優(yōu)化單純皰疹病毒DNA疫苗的研究進(jìn)展

夏 利 程培華 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 桂林 541001)

優(yōu)化單純皰疹病毒DNA疫苗的研究進(jìn)展

夏 利 程培華 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 桂林 541001)

單純皰疹病毒;HSV-DNA疫苗;生殖器皰疹

單純皰疹病毒(HSV)是生殖器皰疹(GH)的主要病原體，主要通過(guò)性接觸傳播。HSV感染機(jī)體后可長(zhǎng)期潛伏在骶神經(jīng)節(jié)中，逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別，因而無(wú)法徹底清除。在一定條件如應(yīng)激、疲勞、免疫力低下等情況下，潛伏病毒被激活而發(fā)病，其復(fù)發(fā)率可高達(dá)80%。GH易復(fù)發(fā)、不易治愈的傾向與患者免疫功能紊亂有關(guān)，抗病毒聯(lián)合免疫治療雖然取得了明顯療效，但是不能有效預(yù)防HSV感染，控制潛伏，減少?gòu)?fù)發(fā)。另外，其服藥時(shí)間長(zhǎng)，停藥后易復(fù)發(fā)，加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前沒有能夠控制其復(fù)發(fā)的特效藥。研制有效的HSV-DNA疫苗成為防治HSV感染的理想方法。如何優(yōu)化HSV-DNA疫苗，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，并取得了一定進(jìn)展，但目前仍無(wú)一種人用HSV-DNA疫苗面世。本文對(duì)近年來(lái)優(yōu)化HSV-DNA疫苗的研究進(jìn)展做一綜述。

1 HSV-DNA疫苗簡(jiǎn)介

DNA疫苗是伴隨現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的新型疫苗，是繼第一代減毒活疫苗和第二代亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗。DNA疫苗是將編碼某種蛋白的外源基因片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒，再用該DNA免疫動(dòng)物，抗原編碼基因能夠在宿主體內(nèi)表達(dá)，并刺激產(chǎn)生針對(duì)該抗原蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。引入的外源基因可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，并不斷表達(dá)外源蛋白，持續(xù)的刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，因此，微量的DNA疫苗即可刺激產(chǎn)生強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答。HSV感染是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫共同參與防御。HSV-DNA疫苗能高效、穩(wěn)定誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴(CTL)效應(yīng)，并且可以共表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子，根據(jù)需要誘導(dǎo)產(chǎn)生最適免疫應(yīng)答，較其他疫苗更有優(yōu)勢(shì)，且安全性更高。加之DNA的易操作性，使HSV-DNA疫苗備受青睞。

包膜糖蛋白參與HSV病毒吸附、入胞、融合、出胞等全過(guò)程，是GH發(fā)病的關(guān)鍵所在。在已知的11種包膜糖蛋白中，糖蛋白D(Gly coprotein D，gD)是高度保守的蛋白，與其他亞群同源性高，具有同種異株的交叉保護(hù)作用。同時(shí)gD具有較強(qiáng)的免疫原性，是產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白，能誘導(dǎo)特異抗HSV抗體產(chǎn)生及活性增強(qiáng)，抑制和中和HSV，從而控制復(fù)發(fā)。gD是特異性CTL識(shí)別位點(diǎn)，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的CTL效應(yīng)。gD具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，因此 HSV-DNA疫苗是目前研究熱點(diǎn)。Cooper等〔1〕認(rèn)為HSV-2gD是制備HSV-DNA疫苗的最佳選擇。gD-DNA疫苗免疫豚鼠可產(chǎn)生高滴度的中和抗體，使HSV失活，減少HSV形成潛伏感染的機(jī)會(huì)，從而有效降低其復(fù)發(fā)率。

近年來(lái)人們開始關(guān)注早期表達(dá)蛋白(ICP)，并將其作為候選蛋白。Haynes等〔2〕通過(guò)HSV-2 ICP27聯(lián)合大腸桿菌耐熱腸毒素(LT)，共免疫小鼠并進(jìn)行攻擊試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)出ICP27特異性免疫反應(yīng)，并可使小鼠免受致死量HSV-2的攻擊。

HSV-DNA疫苗因具有多種優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，各種新型HSV-DNA疫苗已經(jīng)成功構(gòu)建，并且免疫動(dòng)物效果也很明顯，但其臨床試驗(yàn)效果并不如意。國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找其原因，并探求優(yōu)化HSV-DNA疫苗，已取得一定進(jìn)展。

2 增強(qiáng)疫苗免疫原性

2.1 免疫佐劑 某些物質(zhì)若先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑。將一些編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒，如IL-2、IL-12、IL-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSFL)等與DNA疫苗共同轉(zhuǎn)錄后可起到免疫佐劑作用，其被體內(nèi)細(xì)胞攝取后表達(dá)的免疫刺激因子能夠較長(zhǎng)時(shí)間刺激免疫活性細(xì)胞，大大強(qiáng)化了gD蛋白誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫。

Th1細(xì)胞在機(jī)體抗HSV胞內(nèi)感染中發(fā)揮重要作用。微環(huán)境中細(xì)胞因子的種類是影響Th細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。在諸多的細(xì)胞因子中，IL-12起關(guān)鍵作用，有利于Th0向Th1細(xì)胞分化。IL-12可能成為最重要的免疫佐劑。Sin等〔3〕用編碼HSV-2gD的質(zhì)粒與編碼IL-12P40和IL-12P35的質(zhì)粒共注射免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)出高水平的IgA、IgG和IgE，體液免疫明顯增強(qiáng)，同時(shí)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞免疫也明顯增強(qiáng)，共注射可顯著提高刺激指數(shù)。

2.2 CTL表位 以CTL為主的細(xì)胞免疫是抗HSV感染的重要組成部分。CTL表位可誘導(dǎo)有效CTL效應(yīng)，中和HSV顆粒，直接殺傷感染靶細(xì)胞，成為特異性細(xì)胞免疫重要效應(yīng)細(xì)胞之一。因而，CTL為主的細(xì)胞免疫作為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答逐漸受到重視。

CTL表位是內(nèi)源性抗原經(jīng)APC加工、由MHC分子提呈給TCR的短肽，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)也能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答〔4〕。楊慧蘭等〔5〕構(gòu)建的pVAX-gD-CTL添加了特異CTL表位基因，并在小鼠體內(nèi)成功激活出有效的CTL效應(yīng)，其研究結(jié)果表明gD CTL表位的加入明顯提高了CTL的活性，促進(jìn)小鼠Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.3 截短糖蛋白 具有高度免疫原性的HSV-gD-DNA疫苗已經(jīng)成功構(gòu)建，并且形成了有效的免疫保護(hù)作用，但其臨床試驗(yàn)卻不足以抵御HSV感染而宣告失敗。分析其原因可能是由于gD基因較大(共1 182 bp，編碼393個(gè)aa)，將其融合到真核表達(dá)載體，在體內(nèi)表達(dá)的過(guò)程中可能會(huì)失去某些抗原表位。為增強(qiáng)HSV疫苗的抗原性，學(xué)者們?cè)囍コ糠止δ苄缘陌麅?nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的編碼基因，同時(shí)，在不改變其編碼蛋白免疫原性的基礎(chǔ)上，盡量對(duì)其胞外區(qū)進(jìn)行截短。特別是在目前尚未徹底明確完整抗原蛋白是否對(duì)宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對(duì)抗原進(jìn)行截短尤為重要。

馮非等〔6〕對(duì)完整的gB進(jìn)行剪切，從HSV SM44株基因組中擴(kuò)增出HSV-gBt編碼基因，其含有去除了部分N基端的信號(hào)肽序列和部分胞外區(qū)基因組序列，把該目的基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA3中，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pcDNA3-gBt。截短的糖蛋白已被證實(shí)具有明顯的免疫效果。

2.4 模擬抗原表位 隨著噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)的誕生，學(xué)者們開始試著模擬gD的抗原表位，并試圖將其作為新型的候選抗原。于愛蓮等〔7〕從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選針對(duì)HSVgD單克隆抗體的基因，在11個(gè)陽(yáng)性克隆序列中，有9條含有2個(gè)同源性較高的氨基酸序列，即PYH-H和P-PLW，認(rèn)為這2個(gè)氨基酸核心骨架可能是HSVgD的模擬抗原表位?？乖砦挥芯€型構(gòu)象和模擬表位兩種，利用針對(duì)HSV-2gD的單克隆抗體(McAb)從隨機(jī)肽庫(kù)中篩選出相應(yīng)的模擬抗原表位骨架序列。

這些模擬抗原表位不需要預(yù)先確定抗原蛋白質(zhì)的氨基酸序列〔8〕。但其免疫原性及其誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的免疫保護(hù)效應(yīng)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。若能找到基因序列短，免疫原性高的替代抗原，則可謂之找到了一個(gè)新型有效的候選抗原。將多個(gè)模擬抗原表位同時(shí)克隆在同一載體中構(gòu)建多表位復(fù)合疫苗，將為HSV-DNA疫苗提供更有效更廣闊的發(fā)展前景。

2.5 多表位復(fù)合疫苗 將多個(gè)抗原基因?qū)胪惠d體中構(gòu)建多表位復(fù)合疫苗，可大大增強(qiáng)疫苗的免疫原性，從而誘導(dǎo)出強(qiáng)大的免疫保護(hù)作用。對(duì)HSV的抗原性及抗原表位的深入研究，使多表位復(fù)合疫苗成為可能。Domingo等〔9〕對(duì)gD和gB復(fù)合疫苗的研究結(jié)果表明，gD/gB共同免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)效果要優(yōu)于單一糖蛋白免疫的效果。單一抗原表位疫苗用于防治HSV感染具有一定的局限性，多表位復(fù)合疫苗可能是最為理想的疫苗。

徐金華等〔10〕將 HSV-2疫苗的主要候選糖蛋白 gD、gB、gC和早期表達(dá)蛋白ICP27基因融合，成功構(gòu)建了HSV-2多表位復(fù)合疫苗，用其免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生HSV-2特異性IgG和IFN-γ，且CTL活性增強(qiáng)。

3 增強(qiáng)機(jī)體反應(yīng)性

3.1 接種方式 在影響DNA疫苗免疫效果的諸多因素中，接種方式起著關(guān)鍵作用。DNA疫苗通常首選肌肉注射，由于肌肉組織是分化的終末細(xì)胞，將外源DNA整合到細(xì)胞基因組DNA的可能性很小，故該途徑免疫效果不佳。HSV-DNA疫苗接種效率還有待提高。為增強(qiáng)疫苗的導(dǎo)入效率及其隨后誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)，學(xué)者們?cè)噲D用各種接種途徑來(lái)探究其免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。

有科學(xué)家用HSV-2gD經(jīng)不同途徑免疫豚鼠，比較發(fā)現(xiàn)陰道內(nèi)接種對(duì)豚鼠的免疫保護(hù)作用最強(qiáng)〔11〕。徐金華等〔10〕研究結(jié)果表明用脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒比裸質(zhì)粒肌肉注射免疫小鼠能顯著提高其免疫活性。Jazayeri等〔12〕報(bào)道，經(jīng)足底皮下注射(pcDNA3-gD2)免疫小鼠較肌肉注射的免疫效果更好。HSV-DNA疫苗免疫接種途徑較靈活，目前尚未達(dá)到統(tǒng)一。

3.2 表達(dá)載體 DNA疫苗是病原體的保護(hù)性抗原基因和載體的重組質(zhì)粒。HSV-DNA疫苗的研究不斷有新突破，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也分別成功構(gòu)建了不同表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。PcDNA3.1具有真核啟動(dòng)子pcmv，能夠高水平表達(dá)下游蛋白，是構(gòu)建DNA疫苗常用的表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上，Invitrogen公司成功研制了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1。不僅能高水平表達(dá)目的基因，同時(shí)還含有卡那霉素抗性基因的特性，目前已經(jīng)廣泛用于DNA疫苗研制。但目前為止世界上仍沒有一種合適于人用的HSV-DNA疫苗，因?yàn)槟壳皹?gòu)建DNA疫苗的載體質(zhì)粒通常含有氨芐青霉素抗性基因，其副作用較大，不符合人用DNA疫苗載體的安全標(biāo)準(zhǔn)。何方等〔13〕已成功去除了真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3中的氨芐青霉素抗性基因，構(gòu)建了含Kan抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNAKan，為新型HSV-DNA疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

3.3 聯(lián)合免疫 國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在探索新的DNA疫苗方法，如DNA疫苗聯(lián)合免疫，核酸/蛋白的聯(lián)合免疫等。Fotouhi等〔14〕用pcDNA3-gD2免疫小鼠，再有g(shù)D2蛋白加強(qiáng)免疫一次，結(jié)果顯示聯(lián)合免疫效果比單獨(dú)用DNA疫苗或蛋白疫苗免疫兩次要顯著增強(qiáng)。

安全性分析將外源性抗原重組質(zhì)粒DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中，首先要考慮的一個(gè)重要問(wèn)題是安全性。于芳等〔15〕用不同劑量pcDNA3-gB(100，300，500 mg/L)免疫小鼠后，分別檢測(cè)各組小鼠的血液生理學(xué)，血液生化學(xué)指標(biāo)以及8個(gè)重要組織器官的病理學(xué)(心、肝、脾、肺、腎、角膜、腦和三叉神經(jīng)節(jié))，結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化，與對(duì)照組(生理鹽水組)相比無(wú)顯著性差異，初步說(shuō)明pcDNA3-Gb是安全的。

4 展望

HSV感染激發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答傾斜漂移于Th2介導(dǎo)的體液免疫，即發(fā)生了免疫逃避，使得HSV病毒不能有效清除，從而潛伏于神經(jīng)節(jié)。Th1/Th2平衡失調(diào)越嚴(yán)重，GH患者復(fù)發(fā)就越頻繁。因此能否有效誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答是評(píng)價(jià)HSV-DNA疫苗效果的重要指標(biāo)。優(yōu)化HSV-DNA疫苗的最終目標(biāo)是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞免疫，同時(shí)應(yīng)增加T細(xì)胞庫(kù)中特異性CTL細(xì)胞的數(shù)量。多表位復(fù)合DNA疫苗有很好的應(yīng)用前景。無(wú)論是DNA疫苗本身還是免疫佐劑，其免疫效應(yīng)都隨著免疫途徑和劑量的不同而不同，這些將有待進(jìn)一步研究和改進(jìn)。一旦明確其影響效應(yīng)，將有助于DNA疫苗的優(yōu)化，增強(qiáng)其實(shí)用性。同時(shí)也要考慮HSV-DNA疫苗是否存在免疫耐受、基因突變、非目的基因編碼蛋白的副作用。

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R373

A

1005-9202(2012)06-1317-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.06.109

廣西自然科學(xué)基金(2010GXNSFA013249)

程培華(1959-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

夏 利(1986-)，女，碩士，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

〔2011-03-30收稿 2011-09-21修回〕

(編輯 張 慧)