劉玉昆， 劉梅蘭， 王蘊(yùn)慧， 陳 慧， 孟麗麗， 張建平

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510210)

胚胎作為一種半同種移植物，能夠不被排斥，有賴于母胎間的免疫耐受，特別是母胎界面免疫微環(huán)境的形成和維持，一旦免疫耐受遭到破壞，可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)等病理妊娠。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是一種抗原遞呈細(xì)胞，近來(lái)發(fā)現(xiàn)其在免疫耐受中起關(guān)鍵作用，成為免疫耐受機(jī)制研究中的熱點(diǎn)，其在母胎免疫耐受中的作用也受到廣泛關(guān)注［1－2］。研究報(bào)道非成熟型樹(shù)突狀細(xì)胞可以表達(dá)CCL17和CCL22，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)大量表達(dá)趨化因子受體CCR4，CCR4與其配體CCL17和CCL22相互作用在CD4+CD25+Treg的分布和募集中起重要作用。那么蛻膜中樹(shù)突狀細(xì)胞是否表達(dá)CCL17和CCL22?妊娠后蛻膜與妊娠前子宮內(nèi)膜中樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)是否存在差異?復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者母胎界面CD4+CD25+Treg減少是否與蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)異常有關(guān)?目前尚無(wú)此方面的報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)非孕期子宮內(nèi)膜中樹(shù)突狀細(xì)胞和正常妊娠早期以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜中樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)差異，探討母胎界面樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)在母胎免疫耐受和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 研究對(duì)象

1.1 正常早孕組 選擇2008年7月至2009年4月在我院就診的正常早孕、要求人工流產(chǎn)的婦女24例為正常早孕組(孕周＜10周)，年齡27～37歲，既往無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無(wú)染色體畸形、內(nèi)分泌紊亂、生殖道感染病史，無(wú)自身免疫性疾病史。有正常足月分娩1次或以上。本次妊娠期間無(wú)腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)的表現(xiàn)，B超提示胚胎與孕周相符，見(jiàn)心管搏動(dòng)。

1.2 正常未孕組 選取同期在我院就診，因子宮肌瘤行腹式子宮切除術(shù)患者24例，手術(shù)時(shí)為月經(jīng)干凈3～7 d，年齡35～42歲，既往有妊娠史，無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，均排除自身免疫性疾病史。

1.3 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組 選取同期在我院就診的符合不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)(連續(xù)3次或3次以上早期自然流產(chǎn)，夫婦染色體正常，排除內(nèi)分泌、感染因素，無(wú)自身免疫性疾病，無(wú)子宮畸形)患者24例，就診時(shí)為妊娠早期流產(chǎn)(孕周＜12周)，B超提示胚胎無(wú)心管搏動(dòng)，胚胎絨毛染色體檢查正常，年齡27～37歲。3組在納入研究前3個(gè)月均未經(jīng)任何免疫治療和接種。

2 蛻膜或子宮內(nèi)膜單個(gè)核細(xì)胞的分離、體外DC誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定

無(wú)菌狀態(tài)下，正常早孕組于人工流產(chǎn)時(shí)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組清宮時(shí)取蛻膜，正常未孕組于腹式子宮切除時(shí)取子宮內(nèi)膜，每次實(shí)驗(yàn)所用蛻膜或內(nèi)膜均取自2個(gè)標(biāo)本，所取標(biāo)本用Ⅳ型膠原酶/DNA酶Ⅰ消化和密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，分離后的單個(gè)核細(xì)胞用RPMI－1640 完全培養(yǎng)基(含 10%FBS、2 mmol/L L－谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)懸浮，6孔板貼壁2 h，吸棄未貼壁的細(xì)胞，再每孔加入2 mL RPMI－1640完全培養(yǎng)基，并添加細(xì)胞因子粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony－stimulating factor，GM －CSF)和IL －4(終濃度均為20 μg/L)，于第3、5、7 d 半量換液，同時(shí)加入GM－CSF和IL－4(終濃度均為20 μg/L)，第10 d收集細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞及其純度。

3 3組標(biāo)本DC CCL17和CCL22 mRNA表達(dá)的測(cè)定

按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，于第10 d收集DC。依照Invitrogen公司提供的操作步驟提取總RNA，測(cè)定RNA的純度和濃度符合要求后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Promega)。然后以β－actin為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。CCL17的引物序列為:正義鏈5＇－GGG AGT GCT GCC TGG AGT AC － 3＇，反義鏈 5＇－ TAC AAA AAC GAT GGC ATC CCT － 3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 104 bp。CCL22的引物序列為:正義鏈5＇－TGC CGT GAT TAC GTC CGT TA － 3＇，反義鏈 5＇－ AAG GTT AGC AAC ACC ACG CC －3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 101 bp。β －actin的引物序列為:正義鏈5＇－GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT －3＇，反義鏈 5＇－ TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT－3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度106 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:5×SYBR GreenⅠ PCR Buffer 10 μL ，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(3 × 106U/L)1 μL，cDNA 或陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品 5 μL，ddH2O 31 μL，總體積 50 μL。將裝有上述液體的PCR管置于定量PCR儀中，按照如下條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng):93℃ 3 min，然后93℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共40循環(huán)，72℃ 5 min。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入分析界面，以β－actin為內(nèi)參照，計(jì)算各樣本的相對(duì)定量值。

4 ELISA法檢測(cè)DC上清液中CCL17和CCL22的蛋白表達(dá)

按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，于第10 d收集DC。再用RPMI－1640完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞密度為2×105，24 孔板培養(yǎng)，每孔 600 μL，培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后收集上清液，期間不換液。收集的上清液，－20℃凍存?zhèn)溆?。待樣品收集齊后，按Invitrogen公司提供ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)DC培養(yǎng)上清液中CCL17和CCL22蛋白水平。每次設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蛻膜或子宮內(nèi)膜單個(gè)核細(xì)胞分離、體外DC誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定

對(duì)分離的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，每克蛻膜和子宮內(nèi)膜獲得單個(gè)核細(xì)胞約(1～2)×106個(gè)，分離的單個(gè)核細(xì)胞用6孔板貼壁2 h后見(jiàn)圓形貼壁細(xì)胞，經(jīng)GM－CSF聯(lián)合IL－4誘導(dǎo)，倒置顯微鏡觀察顯示:貼壁細(xì)胞形成小的集落，逐漸懸浮，第10 d形成少許突起，以單個(gè)懸浮為主，細(xì)胞仍呈現(xiàn)小而圓、表面突起少等未成熟DC的形態(tài)特征，培養(yǎng)過(guò)程中夾雜有少許細(xì)長(zhǎng)梭狀巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。第10 d輕輕吸取懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液依照FITC －HLADR和PE－Lin小鼠抗人抗體順序標(biāo)記，通過(guò)孵育等處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC，其純度＞80%，見(jiàn)圖2。

2 3組DC CCL17和CCL22 mRNA的表達(dá)

正常早孕組CCL17和CCL22 mRNA水平明顯高于正常未孕組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組高于正常未孕組，差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

3 ELISA法分析3組DC上清液中CCL17和CCL22的表達(dá)

正常早孕組DC能夠持續(xù)旺盛分泌趨化因子CCL17和 CCL22，在培養(yǎng)的12～96 h內(nèi) CCL17和CCL22的分泌量逐漸增多，48 h累積分泌濃度分別為4 481.20 ng/L 和2 708.71 ng/L，96 h 累積分泌濃度分別為5 162.17 ng/L和3 172.56 ng/L。同一時(shí)點(diǎn)早孕組DC分泌的CCL17和CCL22顯著高于正常未孕組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組亦高于未孕組(P ＜0.01)，見(jiàn)表2、3。

Figure 1.Dendritic cells(DC)from human decidua or endometria cultured for 10 d(×200).圖1 光鏡觀察樹(shù)突狀細(xì)胞

Figure 2.Identification of DC by flow cytometry.圖2 樹(shù)突狀細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定

表1 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC CCL17和CCL22 mRNA水平表達(dá)Table 1.CCL17 and CCL22 mRNA expression in DC from decidua or endometria(±s.n=12)

表1 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC CCL17和CCL22 mRNA水平表達(dá)Table 1.CCL17 and CCL22 mRNA expression in DC from decidua or endometria(±s.n=12)

＊＊P ＜ 0.01 vs normal pregnant group;##P ＜ 0.01 vs non －pregnant group.RSA:recurrent spontaneous abortion.

Normal pregnancy 3.04 ±0.40 1.83 ±0.24 Non － pregnancy 0.85 ±0.24＊＊ 0.31 ±0.08＊＊RSA 1.65 ±0.14＊＊## 0.96 ±0.09＊＊##

表2 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC培養(yǎng)不同時(shí)間分泌CCL17濃度比較Table 2.Concentration of CCL17 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

表2 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC培養(yǎng)不同時(shí)間分泌CCL17濃度比較Table 2.Concentration of CCL17 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal pregnancy group;##P ＜0.01 vs non － pregnancy group.

#

表3 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC培養(yǎng)不同時(shí)間分泌CCL22濃度比較Table 3.Concentration of CCL22 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

表3 蛻膜或子宮內(nèi)膜DC培養(yǎng)不同時(shí)間分泌CCL22濃度比較Table 3.Concentration of CCL22 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal pregnancy group;##P ＜0.01 vs non－pregnancy group.

Group 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h Normal pregnancy 2 306.79 ±15.81 2 637.25 ±0.98 2 708.71 ±1.46 3 050.29 ±77.63 3 172.56 ±23.06 Non －pregnancy 92.41 ±8.70＊＊ 100.99 ±10.35＊＊ 118.91 ±2.40＊＊ 126.20 ±1.49＊＊ 130.00 ±12.50＊＊RSA 440.76 ±3.42＊＊## 495.17 ±3.69＊＊## 514.65 ±2.34＊＊## 510.52 ±8.82＊＊## 509.20 ±3.87＊＊##

討 論

1 蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞的分離與純化

獲得足夠數(shù)量及純度的子宮局部樹(shù)突狀細(xì)胞，盡可能模擬體內(nèi)情況，是研究樹(shù)突狀細(xì)胞在母胎免疫耐受中作用或妊娠免疫相關(guān)疾病的基礎(chǔ)。但妊娠時(shí)蛻膜DC占蛻膜細(xì)胞總數(shù)的1%［3］，極大地限制了DC的研究和應(yīng)用。既往應(yīng)用體外組織培養(yǎng)和磁珠或流式細(xì)胞儀分選DC，由于前者分離純度低，后者程序復(fù)雜且消耗大量抗體，均不能快速簡(jiǎn)便地獲取DC。本研究采用蛻膜、子宮內(nèi)膜單核細(xì)胞體外經(jīng)GM－CSF和IL－4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)DC。該法利用單核細(xì)胞具有短暫貼壁特性將其分離出，單核細(xì)胞也是DC前體，可以分化發(fā)育為DC［4］。GM－CSF和IL－4是誘導(dǎo)DC所必需細(xì)胞因子。GM－CSF促進(jìn)DC生長(zhǎng)發(fā)育，IL－4抑制培養(yǎng)體系中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的生成，并維持DC處于未成熟狀態(tài)，TNF－α則促進(jìn)DC的成熟。由于本實(shí)驗(yàn)欲了解原代單核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC分泌CCL17和CCL22的能力，因而未在原代培養(yǎng)第7 d加入TNF－α人為促DC成熟。本研究于第10天收集細(xì)胞，所得到的 DC能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求，便于相關(guān)課題研究的深入開(kāi)展。

2 樹(shù)突狀細(xì)胞在母胎免疫耐受中起重要作用

樹(shù)突狀細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞，以其細(xì)胞表面伸出許多突起為形態(tài)特點(diǎn)，能將外周組織中捕獲的抗原加工處理后傳遞給次級(jí)淋巴組織中的抗原特異性T細(xì)胞，使其活化增殖并引起抗原特異性免疫反應(yīng)。但在某些情況下，樹(shù)突狀細(xì)胞接受抗原刺激后，仍處于非成熟狀態(tài)，這種非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞非但不能引起童真T細(xì)胞活化，反而可使活化T細(xì)胞去能，最終導(dǎo)致免疫耐受［5］。樹(shù)突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)現(xiàn)，使其在移植免疫、自身免疫疾病領(lǐng)域成為研究的熱點(diǎn)。近來(lái)樹(shù)突狀細(xì)胞在母胎免疫耐受中的作用也引起人們的關(guān)注［1－2］。

Gardner等［6］和 Kammerer等［7］對(duì)人蛻膜中樹(shù)突狀細(xì)胞的表型和分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)早孕期蛻膜中存在HLADR+lin－的非成熟型樹(shù)突狀細(xì)胞，免疫組化顯示樹(shù)突狀細(xì)胞散在分布在蛻膜中，在種植部位可見(jiàn)其與滋養(yǎng)細(xì)胞很接近。將蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞分離，發(fā)現(xiàn)其能夠吞噬抗原，但卻不能刺激幼稚T細(xì)胞。Blois等［8］對(duì)孕鼠子宮局部及外周血中的樹(shù)突狀細(xì)胞在孕期的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞在孕5.5 d開(kāi)始上升，8.5 d 達(dá)高峰，9.5 ～17.5 d 為平臺(tái)期。在子宮局部只有＜30%的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類分子，表明大部分樹(shù)突狀細(xì)胞處于非成熟狀態(tài)，并且在孕5.5～8.5 d，MHCⅡ類分子的表達(dá)明顯下降。Plaks等［9］應(yīng)用基因敲除技術(shù)在胚胎種植期清除孕鼠子宮局部的樹(shù)突狀細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致蛻膜化失敗和流產(chǎn)，可見(jiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞在妊娠種植中起重要作用。

3 妊娠期蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22表達(dá)增加的意義

樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的趨化因子在局部炎癥免疫和腫瘤免疫中T細(xì)胞的募集過(guò)程中起重要作用，且隨著樹(shù)突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的不同，分泌的趨化因子呈動(dòng)態(tài)變化，從而使其所募集的淋巴細(xì)胞不同［10－11］。具有免疫耐受作用的DC可以表達(dá)CCL17和CCL22［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮局部?jī)?nèi)膜或蛻膜DC能表達(dá)CCL17和 CCL22，正常妊娠后蛻膜 DC表達(dá)CCL17和CCL22不管在mRNA水平還是蛋白水平上均顯著高于正常未孕者。CCL17和CCL22是CD4+CD25+Treg的趨化因子，CD4+CD25+Treg上表達(dá)CCL17和CCL22的受體CCR4。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) DC可通過(guò)分泌CCL17和CCL22引導(dǎo)CD4+CD25+Treg游走［13］。CCL17和 CCL22在 CD4+CD25+Treg的分布、募集中起重要作用。Kang等［14］應(yīng)用基因沉默技術(shù)降低樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)可明顯減少局部CD4+CD25+Treg的募集。妊娠后體內(nèi)激素發(fā)生很大變化，雌激素、孕激素、絨毛膜促性腺激素等顯著增多，已有研究發(fā)現(xiàn)，孕激素可誘導(dǎo)蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞分化為具有免疫耐受功能的未成熟型樹(shù)突狀細(xì)胞［15］。推測(cè)蛻膜中未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的增多使其表達(dá)CCL17和CCL22增加，從而可以募集更多的CD4+CD25+Treg到母胎界面。CD4+CD25+Treg能夠限制效應(yīng)性T細(xì)胞或清除抗原特異性T細(xì)胞，眾多研究已證實(shí)其在母胎免疫耐受中的重要作用［16－17］，而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面 CD4+CD25+Treg較正常妊娠者明顯減少［18］。本研究中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)明顯低于正常妊娠者，推測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞CCL17和CCL22的表達(dá)下降可導(dǎo)致募集到母胎界面的CD4+CD25+Treg減少，從而引起母胎免疫耐受的破壞，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等病理妊娠。

［1］Pollard JW.Uterine DCs are essential for pregnancy［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3832 －3835.

［2］Blois SM，Kammerer U，Alba Soto C，et al.Dendritic cells:key to fetal tolerance?［J］.Biol Reprod，2007，77(4):590－598.

［3］Banchereau J，Briere F，Caux C，et al.Immunobiology of dendritic cells［J］.Annu Rev lmmunol，2000，18:767 －811.

［4］Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3):259－262.

［5］Shortman K，Heath WR.Immunity or tolerance?That is the question for dendritic cells［J］.NatImmunol，2001，2(11):988－989.

［6］Gardner L，Moffett A.Dendritic cells in the human decidua［J］.Biol Reprod，2003，69(4):1438 －1446.

［7］Kammerer U，Eggert AO，Kapp M，et al.Unique appearance of proliferating antigen－presenting cells expressing DC－SIGN(CD209)in the decidua of early human pregnancy［J］.Am J Pathol，2003，162(3):887 －896.

［8］Blois SM，Alba Soto CD，Tometten M，et al.Lineage，maturity，and phenotype of uterine murine dendric cells through gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy［J］.Biol Reprod，2004，70(4):1018 －1023.

［9］Plaks V，Birnberg T，Berkutzki T，et al.Uterine DCs are crusial for decidua formation during embryo implantation in mice［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3954 －3965.

［10］Muthuswamy R，Urban J，Lee JJ，et al.Ability of mature dendritic cells to interact with regulatory T cells is imprinted during maturation［J］.Cancer Res，2008，68(14):5972－5978.

［11］Beaty SR，Rose CE Jr，Sung SS.Diverse and potent chemokine production by lung CD11bhighdendritic cells in homeostasis and in allergic lung inflammation［J］.J Immunol，2007，178(3):1882 －1895.

［12］Yogo Y，F(xiàn)ujishima S，Inoue T，et al.Macrophage derived chemokine(CCL22)，thymus and activation－regulated chemokine(CCL17)，and CCR4 in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Respir Res，2009，10(1):80.

［13］Valmori D，Liénard D，Waanders G，et al.Analysis of MAGE－3－specific cytolytic T lymphocytes in human leukocyte antigen － A2 melanoma patients［J］.Cancer Res，1997，57(4):735 －741.

［14］Kang S，Xie J，Ma S，et al.Targeted knock down of CCL22 and CCL17 by siRNA during DC differentiation and maturation affects the recruitment of T subsets［J］.Immunobiology，2010，215(2):153 －162.

［15］沈 媛，曾耀英，肇靜嫻.孕酮對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和免疫功能的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(6):1143－1147.

［16］黃立峰，姚詠明，盛志勇.樹(shù)突狀細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(3):610 －616.

［17］Saito S，Sasaki Y，Sakai M.CD4+CD25highregulatory T cells in human pregnancy［J］.J Reprod Immunol，2005，65(2):111－120.

［18］Mei S，Tan J，Chen H，et al.Changes of CD4+CD25highregulatory T cells and FOXP3 expression in unexplained recurrent spontaneous abortion patients［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2244 －2247.