急慢性注射地卓西平馬來酸鹽對小鼠額葉m icroRNA-181b表達的影響☆

向熙 劉衛(wèi)青 余藝 王棟 陳曉崗

急慢性注射地卓西平馬來酸鹽對小鼠額葉m icroRNA-181b表達的影響☆

向熙*劉衛(wèi)青△余藝△王棟△陳曉崗△*

目的 研究急慢性注射地卓西平馬來酸鹽（MK-801）對小鼠額葉中與精神分裂癥相關的微小RNA（microRNA，miRNA）-181b表達的影響，探討其參與精神分裂癥病理學的可能機制。方法 急性注射實驗中40只小鼠隨機分成四組，分別腹腔注射不同劑量（0.125 mg／kg，0.25 mg／kg，0.50 mg／kg）的 MK-801 和生理鹽水（簡稱急性對照組），15 min后用實時熒光定量PCR（real-time PCR）技術檢測額葉miRNA-181b的相對表達量；慢性注射實驗中 22只小鼠隨機分成兩組，分別腹腔注射 0.25 mg·kg－1·d－1的 MK-801和生理鹽水（簡稱慢性對照組），連續(xù) 14 d，然后檢測 miRNA-181b 的相對表達量。 結果 急性注射 0.125 mg／kg、0.25mg／kg、0.50 mg／kg MK-801的各組小鼠額葉 miRNA-181b 的相對表達水平分別為 0.65 ± 0.05、 0.61 ± 0.05 和 0.91 ± 0.08。 前兩個劑量組 miRNA-181b 的表達明顯低于對照組（1.00 ± 0.13），P＜ 0.05，而 0.5 mg／kg的 MK-801 則對 miRNA-181b表達無影響（P＞0.05）。慢性 MK-801注射組 miRNA-181b的相對表達量為 1.86±0.19，顯著高于慢性對照組（1.00±0.10），P＜0.05。結論 急性和慢性MK-801對額葉中miRNA-181b表達的影響不同，結合miR-181b的分子功能，提示miRNA-181b在急性和慢性模型鼠的構建中起到不同的作用。

地卓西平馬來酸鹽 額葉 microRNA-181b實時熒光定量PCR

已有的研究顯示，精神分裂癥患者腦中多個部位微小 RNA（microRNA，miRNA）的表達異常［1－3］，miRNA能通過轉錄后沉默機制調控多個基因的表達，因此腦中miRNA水平的微小失調，可能會導致其靶基因參與的分子通路的紊亂［4］。其中，miR-181b在精神分裂癥患者的顳上回中表達過量，且能抑制離子型谷氨酸受體AMPA受體亞基2（GluR2）基因的翻譯［5］。 谷氨酸信號通路是腦中重要的神經(jīng)遞質傳導通路，其功能低下假說是精神分裂癥的重要假說之一。然而，谷氨酸功能低下如何造成精神分裂癥的一系列癥狀尚不明了，其是否會導致miR-181b表達的失調，從而影響下游功能蛋白的表達，目前也無報道。非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK-801），能在人及動物中較好的模擬精神分裂樣行為［6－7］，被廣泛的用于制作谷氨酸功能低下的動物模型。因此，本研究采用急、慢性注射MK-801的方法制備此小鼠模型，檢測谷氨酸信號通路的紊亂對額葉中miR-181b表達的影響，并結合miR-181b的分子功能，探討miR-181b在谷氨酸信號通路中起到的調節(jié)作用及其參與精神分裂癥的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物 成年雄性C57BL／6小鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限公司），實驗初期體重為20 g～25 g。實驗前所有小鼠在動物房恒溫（22±1℃）、濕度 50%～ 55%、12 h 晝夜節(jié)律 （8：00－20：00）下適應性飼養(yǎng)5 d，自由飲水及進食。所有小鼠在腹腔注射前每天用手撫摸抓取幾次。所有實驗均在8：00－19：00之間完成。本實驗獲得中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物管理委員會批準。

1.2 試劑 MK-801購自美國Sigma-Aldrich公司，用滅菌生理鹽水配成1mg／mL的儲存液，在實驗 前 再 配 制 成 0.0125 mg／mL、0.025 mg／mL、0.05 mg／mL 的工作液。

1.3 小鼠腹腔注射MK-801 急性MK-801注射實驗中40只小鼠隨機分成四組，每組10只，分別腹腔注 射 0.125 mg／kg、0.25 mg／kg、0.5 mg／kg 的MK-801和生理鹽水，注射體積為10mL／kg。注射完成15min后，立即將小鼠斷頸取腦，于冰上快速獲取額葉部位后，將組織放于液氮中冷激5 s～10 s，置于－70℃冰箱保存待用。

慢性MK-801注射實驗中22只小鼠隨機分為兩組，每組 11 只，分別腹腔注射 0.25mg／kgMK-801和生理鹽水，注射體積為10mL／kg，連續(xù)注射14 d。0.25mg／kg的劑量不會引起后肢肌力障礙及明顯的共濟失調等神經(jīng)毒性表現(xiàn)［14］。最后一次注射完成后15min，立即將小鼠斷頸取腦，用同樣的方法獲取額葉組織并保存。

1.4 額葉m iRNA-181b表達檢測 用Trizol試劑提取小鼠額葉組織的RNA，測純度及完整度，符合實驗要求后，用miRNA逆轉錄試劑盒 （大連寶生物公司）將miRNA逆轉錄為cDNA，之后采用SybrGreen熒光定量法檢測miRNA-181b的相對表達量。計算方法為已報道過的 2-ΔΔCt法［8］。每個模板做兩個重復管以計算平均ΔCt值。用于實時熒光定量的 miRNA-181b的下游引物為 5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT-3′，內參基因 U6 snRNA的下游引物為 5′-CGGCAGCACATATAC TAAAATTGG-3′。上游引物均為實時熒光定量試劑盒 （大連寶生物公司）提供的Uni-miR qPCR Primer。采用 ABI StepOne Plus實時定量 PCR儀進行檢測，根據(jù)儀器說明每板40個循環(huán)，反應時間溫度為 95℃ 30 s預變性后，95℃ 5 s、60℃ 34 s循環(huán) 40 次，之后 95℃ 15 s，60℃ 60min，95℃ 15 s繪制溶解曲線。PCR產(chǎn)物的長度用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測鑒定，同時鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤來表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），LSD進行組間兩兩比較。檢驗水準α＝0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 急性注射不同劑量MK-801對小鼠額葉中m iR-181b表達的影響 不同劑量MK-801急性注射組與對照組中小鼠額葉miRNA-181b相對表達量的比較見表1。由表1可見，在0.125mg／kg和0.25mg／kg的劑量時，注射完成15min后小鼠額葉中miRNA-181b表達量相對于急性對照組顯著降低，分別為急性對照組的 （65±5）%和 （61±5）%，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 而在 0.5mg／kg的注射劑量時，則與對照組比無統(tǒng)計學差異［為對照組的（91 ± 8）%，P ＞ 0.05］。

2.2 慢性注射 MK-801對小鼠額葉中 m iRNA-181b表達的影響 連續(xù)14d慢性注射MK-801（每天 0.25mg／kg）， 導致小鼠額葉 miRNA-181b 表達的變化見表 2。表 2顯示0.25mg／kg MK-801的慢性注射組，miRNA-181b相對于慢性對照組顯著升高，是慢性對照組的（186±19）%，差異有統(tǒng)計學意義（t＝ －4.13，P ＜ 0.01）。

3 討論

最近的研究表明，精神分裂癥可能與患者腦部 miRNA 的表達異常有關［2，9－11］。 本研究利用谷氨酸功能低下的小鼠模型，以miRNA-181b為對象，探討了谷氨酸信號通路與額葉中miRNA-181b表達的關系。結果顯示，急性注射中低劑量的MK-801使小鼠額葉miRNA-181b表達顯著減少。體外細胞轉染實驗和熒光素酶報告基因檢測證實，miRNA-181b作用的靶基因為離子型谷氨酸AMPA受體亞基2（GluR2）。急性阻斷谷氨酸受體（包括NMDA受體和AMPA受體）后，可能由于反饋性機制引起相關的miRNA（如miRNA-181b等）表達下調［12］。由miRNA的轉錄后沉默機制可知，額葉中miRNA-181b表達的下調，會使GluR2蛋白表達受到的抑制減少。GluR2是谷氨酸AMPA受體的一個重要組成型亞基，其存在對于AMPA受體的轉運和裝配有重要作用［13］。因此，GluR2表達的增多，會提高離子型谷氨酸AMPA受體在皮層細胞膜表面轉運和裝配的效率，從而增強額葉部位的谷氨酸功能。

表1 不同劑量MK-801急性注射組與對照組中小鼠額葉m iRNA-181b相對表達量的比較（±s）

表1 不同劑量MK-801急性注射組與對照組中小鼠額葉m iRNA-181b相對表達量的比較（±s）

1）與急性對照組比較，經(jīng) LSD檢驗，P＜0.05

組別0.125mg ／kg MK-801 0.25mg／kg MK-801 0.5mg ／kg MK-801急性對照組n 10 10 10 10 miR-181b相對表達量0.65 ± 0.051）0.61 ± 0.051）0.91 ± 0.08 1 ± 0.13

表2 慢性MK-801注射組與對照組中小鼠額葉m iR-181b相對表達量的比較（±s）

表2 慢性MK-801注射組與對照組中小鼠額葉m iR-181b相對表達量的比較（±s）

1）與急性對照組比較，經(jīng) LSD檢驗，P＜0.05

組別慢性MK-801組慢性對照組n 11 11 miR-181b相對表達量1.86 ± 0.191）1.00 ± 0.10

這些急性劑量的MK-801注射引起的動物行為學異常，如自發(fā)活動增加和刻板行為［14］，一般會持續(xù)2～ 3 h［15］。 在這一過程中，miRNA-181b 下調引起的下游GluR2表達的增加，對于急性MK-801刺激誘發(fā)的動物行為學異?？赡芷鸬降挚购途徑庾饔?。

高劑量 MK-801 （0.5mg／kg） 時 miRNA-181b表達并不改變。已有的研究證明，慢性注射不同劑量的 MK-801（0.01 mg／kg～ 1mg／kg）會導致大鼠前額葉皮質中NMDA受體的亞基 （NR1，NR2A～D）mRNA水平呈倒U型曲線變化［6］。類似于該研究，我們推測，不同劑量的MK-801對額葉中miRNA-181b表達的調節(jié)可能是呈正U型曲線變化的，中低劑量的MK-801使miRNA-181b表達下調，隨后隨著注射劑量的增加而表達增加，0.5mg／kg的劑量可能正好處于不改變miRNA表達的劑量范圍。然而不改變miRNA表達的低劑量端我們尚未實驗。對于這一點還需進一步的實驗研究。

連續(xù)14 d的慢性注射MK-801除阻斷NMDA受體外，可致額葉miRNA-181b顯著上調，具體機制不明。慢性注射組中該miRNA的表達上調，會降低額葉皮層細胞離子型谷氨酸AMPA受體的水平，同時通過直接阻斷NMDA受體，從而降低額葉部位谷氨酸功能。該結果與Beveridge等在精神分裂癥患者腦顳上回中報道的結果一致［1］，提示我們在分子水平慢性MK-801注射能更好的模擬精神分裂癥。 前人的研究表明［16－17］，慢性注射誘發(fā)的動物模型，在給藥完成后的很長一段時間，也能持久并穩(wěn)定的模擬類精神分裂行為。因此，慢性MK-801刺激所誘發(fā)的持久并穩(wěn)定的動物行為學異常，可能是藥物空間阻斷NMDA受體通路和擾亂miRNA-181b表達并最終降低離子型谷氨酸AMPA受體水平這兩者雙重作用的結果。

急慢性注射MK-801導致小鼠額葉中miRNA-181b呈現(xiàn)相反的變化趨勢，雖然機制尚未知，但類似的研究可以提供一些參考依據(jù)。Zuo等［16］及Tsukada等［18］分別在對小鼠及猴子的研究中發(fā)現(xiàn)，急性MK-801會使前額葉皮質中外谷氨酸和多巴胺的釋放增多，而慢性MK-801會使二者的釋放減少，該機制也尚未知。因此推測，急性和慢性MK-801導致的miRNA-181b的不同變化，可能與額葉中胞外谷氨酸和多巴胺水平有關，且可能呈負相關。這些研究及本實驗結果反映了急性和慢性MK-801構建的動物模型在分子表達及腦中谷氨酸、多巴胺的釋放水平上存在的差異。

由本研究可知，谷氨酸信號通路的紊亂會導致額葉中miRNA-181b表達變化，且急性和慢性MK-801對miRNA-181b的表達影響不同，提示miRNA-181b在急性和慢性模型鼠的構建中起到不同的作用。急性注射采用的MK-801的劑量可能缺乏代表性，進一步的研究需要增加急性注射劑量的梯度，以探討不同劑量的MK-801對miRNA-181b的表達影響呈何種變化趨勢。另外，胞外谷氨酸或多巴胺的釋放與額葉中部分miRNA表達的關系，也是我們需要進一步研究的課題。

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The effects of acute and chronic dizocilpine maleate exposure on the expression of m icroRNA-181b in the mouse frontal cortex.

XIANG Xi，LIU Weiqing，YU Yi，WANG Dong，CHEN Xiaogang.Institute of Genomic Medicine，Wenzhou Medical College， 82 Xueyuan Road， Wenzhou 325000.Tel： 0577－88830225.

ObjectiveTo explore the effects of acute and chronic dizocilpine （MK-801） exposure on the expression ofmicroRNA（miR）-181b， a schizophrenia-associated microRNA， in the frontal cortex ofmouse brain and its potential role in the pathogenesis of schizophrenia.M ethods In the acute experiment， forty mouse were divided into four groups random ly， the MK-801 and control groups were given intraperitoneal injection of different doses of MK-801 （0.125 mg／kg， 0.25 mg／kg and 0.5 mg／kg） and vehicle， respectively.In the chronic experiment， twenty-two mice were divided into two groups random ly.Mice were given vehicle or MK-801 （0.25 mg／kg per day） for 14 d.Quantitative real-time PCR technique was then used to detect the relative expression levels ofmiR-181b in the frontal cortex at 15 min after treatment in acute experiment or at 15 min after last injection on 14th day in chronic experiment.Results In the acute MK-801 administration groups， relative expression levels ofmiR-181b were 1.00 ± 0.13 in control group， 0.65 ± 0.05 in 0.125 mg／kg group， 0.61 ± 0.05 in 0.25 mg／kg group， and 0.91 ± 0.08 in 0.5 mg／kg group， respectively. MiR-181b expression levels significantly decreased in MK 0.125 mg／kg and MK 0.25 mg／kg groups while remained unchanged in 0.5 mg／kg group compared to the control group.In the chronic MK-801 administration group， relative expression level of miR-181b significantly increased compared to the control group（1.86 ± 0.19vs.1.00 ± 0.10，P＜ 0.05）.Conclusion There are different effects of acute and chronic administra-tion of MK-801 on miR-181b in the mouse frontal cortex，indicating thatmiR-181b may play different roles in the acute and chronic mousemodels of schizophrenia.

Dizocilpine maleate Frontal cortex MicroRNA-181b qPCR

R749.3

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.006

☆ 國家自然科學基金重點項目（編號：30870893）

* 溫州醫(yī)學院基因組醫(yī)學研究院（溫州 325000）

（E-mail：chenxghn＠yahoo.com.cn）

△ 中南大學湘雅二醫(yī)院精神衛(wèi)生研究所

2011－11－02 ）

文飛）

·論 著·