梅雪臣，黃加軍，曹玉飛，熊儒先，劉超帝，繆禮鴻*

（1.武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，廣西 北海 536100）

木薯酒糟液是以木薯為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精蒸餾后的廢醪液，其COD達50000mg/L～100000mg/L，治理難度較大。酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)和18種氨基酸，還有未被利用的脂肪、纖維素和酵母菌體等營養(yǎng)成分[1]。因此，對其進行開發(fā)利用，不僅能解決酒糟的污染問題，還能變廢為寶，實現(xiàn)資源的二次利用[2]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的安全益生菌之一，因其具有抗逆性強、代謝過程中可產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶等有益因子現(xiàn)已在飼料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[3-4]。枯草芽孢桿菌還能有效降解水體中的氨氮和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)而具有凈化水質(zhì)的作用，在養(yǎng)殖水體的生物修復(fù)方面具有廣泛的應(yīng)用[5]。

高效、廉價的液體發(fā)酵培養(yǎng)基微生物制劑產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化以提高液體培養(yǎng)的活菌數(shù)對微生物制劑的生產(chǎn)具有重要意義[6-8]。本研究以枯草芽孢桿菌為研究對象，通過單因子和正交試驗對以木薯酒糟液為基礎(chǔ)的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為木薯酒糟液的資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：枯草芽孢桿菌BA1即水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌，為市購的某公司生產(chǎn)的商品化菌種，主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖；解淀粉芽孢桿菌T1和枯草芽孢桿菌A6由武漢工業(yè)學(xué)院資源與環(huán)境微生物研究室提供。

木薯酒糟液（pH4.2，COD 85000mg/L）：由廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司提供。

復(fù)合氮源營養(yǎng)液：含有機氮和氨基酸態(tài)氮，總氮含量9.70%。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 木薯酒糟基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

木薯酒糟液100%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.2 木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基

木薯酒糟液98.8%，1.0%蔗糖，0.10%蛋白胨，0.10%（NH4）2SO4，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.3 牛肉膏培養(yǎng)基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.2.4 碳源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

木薯酒糟液99.0%，蔗糖1.0%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.5 氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

木薯酒糟液99.9%，蛋白胨0.10%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.3 種子液的制備

將活化好的芽孢桿菌接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h。

1.4 活菌數(shù)測定方法

采用稀釋平板涂布計數(shù)法，菌懸液涂布于牛肉膏固體培養(yǎng)基平板后于37℃恒溫培養(yǎng)24h計數(shù)菌落數(shù)。

1.5 不同芽孢桿菌發(fā)酵酒糟液

采用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至6.0。按5%接種量分別接種水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌BA1、解淀粉芽孢桿菌T1、枯草芽孢桿菌A6 種子液，培養(yǎng)溫度37℃，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h，取樣測定培養(yǎng)液中芽孢桿菌的活菌數(shù)。并分別以木薯酒糟基礎(chǔ)培養(yǎng)基和牛肉膏培養(yǎng)基作為對照。

1.6 單因子試驗

1.6.1 發(fā)酵時間對芽孢桿菌菌數(shù)的影響

采用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH值為6.0。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床分別培養(yǎng)18h、21h、24h、28h，取樣測定不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)。

1.6.2 培養(yǎng)基pH值對水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

采用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基，用40%NaOH分別調(diào)培養(yǎng)基pH值至5.0、5.5、6.0、6.5，按5%接種量接種枯草芽孢桿菌種子液，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h，測定各不同pH值培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)。

1.6.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

采用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH值為6.0。分別按3%、5%、7%、10%接種量接種枯草芽孢桿菌種子液，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h，測定不同接種量條件下培養(yǎng)液中的活菌數(shù)。

1.6.4 不同碳源對水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為1%。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h，測定各培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)。

1.6.5 不同氮源對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

選擇蛋白胨、硫酸銨、尿素和復(fù)合氮源營養(yǎng)液4種氮源分別加入碳源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為0.1%。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)24h，測定各培養(yǎng)液中草芽孢桿菌的活菌數(shù)。

1.7 正交試驗

通過上面單因子試驗，選擇2種氮源（尿素、復(fù)合氮源營養(yǎng)液）及2種碳源（葡萄糖、蔗糖）和3個濃度添加水平，采用L9（34）正交試驗法（表1）確定最佳培養(yǎng)基配方。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 離心干燥測活菌數(shù)

枯草芽孢桿菌BA1發(fā)酵菌液經(jīng)4000r/min離心5min，棄上清得到離心沉淀菌體，取少量離心菌體進行稀釋平板測活菌數(shù)；剩余菌體經(jīng)55℃恒溫干燥箱烘干、粉碎后制備成固體菌劑，并取樣測活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同芽孢桿菌發(fā)酵酒糟液

采用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌BA1、A6菌株及解淀粉芽孢桿菌T1菌株。由表2可知，解淀粉芽孢桿菌T1在牛肉膏種子液中的菌數(shù)最高為11.2×108cfu/mL，而水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌BA1在木薯酒糟發(fā)酵液中的菌數(shù)最高為14.3×108cfu/mL。因此選定BA1菌株為后續(xù)試驗的發(fā)酵菌種。3株芽孢桿菌在不補加任何外源營養(yǎng)的木薯酒糟基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的菌數(shù)均較低，因此，需要對以木薯酒糟液為基礎(chǔ)的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以便獲得更高的發(fā)酵活菌數(shù)。

表2 不同芽孢桿菌發(fā)酵酒糟液菌數(shù)比較Table 2 Viable counts of different Bacillus strains grown in cassava lees wastewater medium

2.2 單因子試驗

2.2.1 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

利用木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基，比較不同發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌BA1菌數(shù)影響。結(jié)果表明（圖1），發(fā)酵24h時BA1的活菌數(shù)最高，達17×108cfu/mL。因此，培養(yǎng)時間為24h為宜。

圖1 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌BA1菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on viable count of B.subtilis BA1

2.2.2 培養(yǎng)基pH值對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基的pH值為6.0時枯草芽孢桿菌BA1的活菌數(shù)最高，為最適宜生長的pH值，pH5.0、pH5.5和pH 6.5時的培養(yǎng)基活菌數(shù)明顯偏低。

2.2.3 種子菌懸液接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

不同接種量的試驗表明（圖3），培養(yǎng)，接種量為5%時枯草芽孢桿菌BA1的活菌數(shù)最高，接種量為3%時BA1活菌數(shù)最低。接種量為5%、7%、10%時BA1的活菌數(shù)相差不大，但是考慮到經(jīng)濟成本問題接種量為5%已經(jīng)可以滿足發(fā)酵要求，因此最優(yōu)接種量為5%。

圖2 培養(yǎng)基p H值對枯草芽孢桿菌BA1活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of pH value on viable count of B.subtilis BA1

圖3 接種量對枯草芽孢桿菌BA1活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of inoculum on viable count of B.subtilis BA1

2.2.4 不同碳源對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

向木薯酒糟基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別補加4種碳源的試驗結(jié)果（圖4）表明，葡萄糖和蔗糖作為木薯酒糟液培養(yǎng)基的補充碳源最適宜芽孢桿菌BA1的生長，活菌數(shù)相對于糖蜜和可溶性淀粉高很多。

圖4 碳源對用枯草芽孢桿菌BA1活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of carbon source on viable count of B.subtilis BA1

2.2.5 不同氮源對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

向木薯酒糟基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別補加4種氮源的試驗結(jié)果表明（圖5），添加復(fù)合氮源營養(yǎng)液時BA1活菌數(shù)最高，為最佳氮源。分別添加尿素和蛋白胨的培養(yǎng)基活菌數(shù)相當(dāng)，但尿素的使用成本更低，因此正交試驗選擇復(fù)合氮源營養(yǎng)液和尿素作為補加氮源。

2.3 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

采用L9（34）正交試驗確定枯草芽孢桿菌BA1最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方。由表3可知，極差R值的大小分別為C＞B＞A＞D，即對枯草芽孢桿菌生長影響由大到小依次為葡萄糖、復(fù)合氮源營養(yǎng)液、尿素和蔗糖。

圖5 氮源對枯草芽孢桿菌BA1活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on viable count of B.subtilis BA1

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal test

通過直觀分析和方差分析，理論上A3B1C2D1的組合為最優(yōu)方案，但在9個試驗號中都沒有出現(xiàn)，正交表中A3B3C2D1的活菌數(shù)在9個試驗中最高，其次是A2B1C2D3。因此，選擇A3B1C2D1，A3B3C2D1，A2B1C2D3的組合進行驗證試驗，同時用牛肉膏培養(yǎng)基作為參比培養(yǎng)基，每個處理3次重復(fù)。由表5可知，A3B1C2D1的活菌數(shù)最高，達35.0×108cfu/mL，而牛肉膏液體培養(yǎng)液活菌數(shù)僅為12.0×108cfu/mL，其活菌數(shù)是牛肉膏液體培養(yǎng)基活菌數(shù)的2.9倍。與表2中數(shù)據(jù)比較，A3B1C2D1的活菌數(shù)分別為木薯酒糟基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和未優(yōu)化的木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)的9.46倍和2.45。因此，枯草芽孢桿菌BA1的最佳補料配方為葡萄糖2.0%，復(fù)合氮源營養(yǎng)液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%。

2.4 離心干燥測數(shù)結(jié)果

按A3B1C2D1培養(yǎng)基配方發(fā)酵BA1，發(fā)酵液離心后測得新鮮離心沉淀菌體的活菌數(shù)為60×108cfu/g；離心沉淀菌體的含水率為84.0%。菌體經(jīng)干燥、粉碎后得到的枯草芽孢桿菌菌劑實測活菌數(shù)為140×108cfu/g，與新鮮離心沉淀菌體的總菌數(shù)相比，干燥后菌劑的活菌數(shù)存活率明顯偏低，其原因有待進一步研究分析。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

表5 驗證試驗（為3 次重復(fù)的平均值）Table 5 Verification experiment (Average number of 3 repeats)

3 結(jié)論

用木薯酒糟培養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌BA1菌株，其最優(yōu)培養(yǎng)基配方為木薯酒糟液96.6%，葡萄糖2.0%，復(fù)合氮源營養(yǎng)液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%，pH為6.0。最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度37℃，搖床170r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌BA1活菌數(shù)可達35.0×108cfu/mL，分別為木薯酒糟基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化前的木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)的9.46倍和2.45倍。發(fā)酵菌液經(jīng)離心、干燥后得到枯草芽孢桿菌BA1菌劑的活菌數(shù)達140×108cfu/g。

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