紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

楊雅利，闞建全*，沈海亮，廖 晨，胡益僑

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

楊雅利，闞建全*，沈海亮，廖 晨，胡益僑

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

以四川達(dá)州生產(chǎn)的紫甘薯為原料，應(yīng)用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對紫薯酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，從而確定紫薯酒發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：對糊化過的紫甘薯進(jìn)行打漿后，在pH值為6.5，α-淀粉酶添加量為0.15%，溫度為65℃，酶解時間為2.5h的條件下進(jìn)行液化；在pH值為4.0，糖化酶的添加量為0.15%，酶解時間為2.5h，溫度為60℃的條件下進(jìn)行糖化；然后再對紫甘薯酒調(diào)節(jié)pH值為3.355，添加0.0845%的安琪釀酒高活性干酵母，在溫度20.72℃的條件下，發(fā)酵7d，即可得到酒度為10°左右的一種新型的紫薯發(fā)酵酒，其得率為126.3%。

紫甘薯；紫薯酒；響應(yīng)面法；液化；糖化；發(fā)酵

紫甘薯是我國近年來從國外引進(jìn)的紅薯新品種，薯肉呈紫色至深紫色，學(xué)名是Solanum tuberdsm，科屬是旋花科番薯屬，又稱為“黑薯、紫番薯、紫甘薯、紫心山芋”[1]。它的野生種起源于美洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)全國廣為栽培[2]。

紫肉甘薯除了具有普通甘薯的生理保健功能以外，還具有許多獨(dú)特的保健藥用價值。紫薯中纖維素的含量豐富，可增加糞便體積，促進(jìn)腸胃蠕動，清理腸腔內(nèi)滯留的黏液、積氣和腐敗物，排出有毒物質(zhì)和致癌物質(zhì)，保持大便暢通，改善消化道環(huán)境，防止胃腸道疾病的發(fā)生。另外，紫甘薯花色苷的主要成分是矢車菊

色素和芍藥色素，具有較好的耐熱性和耐光性，并且具有提高視覺靈敏性，抑制脂質(zhì)過氧化，防止血小板聚集，維持血管正常的通透性，預(yù)防糖尿病以及抗腫瘤、抗突變和抗輻射等多種生理功能[3-8]。本研究以四川達(dá)州生產(chǎn)的紫色甘薯為原料，通過響應(yīng)面法對紫薯酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定紫色甘薯酒最佳的發(fā)酵工藝條件，并對優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為以后進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯，產(chǎn)地四川達(dá)州，主要成分含量(%)：淀粉20.11、粗纖維0.78、蛋白質(zhì)1.54、脂肪0.21、總灰分0.69、水分68.25、還原糖3.75，花色苷含量14.48mg/g。

α-淀粉酶(酶活力＞3700U/g)、糖化酶(酶活力＞105U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌種

釀酒高活性干酵母 安琪酵母有限公司；法國拉曼酵母(D254) 上海杰兔工貿(mào)有限公司；酒用干酵母 廣東省馬利酵母有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

722-P可見分光光度計(jì) 上?，F(xiàn)科儀器有限公司；SL602N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-3F型酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；HH·B11·420-S-Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PSX-280A型手提高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。1.4方法

1.4.1 紫薯酒的制作工藝流程

紫甘薯→蒸煮糊化→打漿→調(diào)節(jié)pH值→α-淀粉酶酶解液化→調(diào)節(jié)pH值→糖化酶酶解糖化→調(diào)節(jié)pH值→加釀酒酵母→發(fā)酵7d→過濾→殺菌→紫甘薯酒

1.4.2 菌種的活化方法

將5%的干酵母，加入到含糖5%的糖水中，在溫度38℃條件下，攪拌活化約15～30min，直至糖水中出現(xiàn)大量的小氣泡為止。

1.4.3 紫甘薯的α-淀粉酶水解液化條件研究

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對糊化過的紫甘薯以1:1.5的料液比進(jìn)行打漿過后，用檸檬酸和NaOH調(diào)節(jié)pH值，加入α-淀粉酶進(jìn)行液化，以水解度為指標(biāo)，對溫度、時間、pH值、α-淀粉酶添加量為影響因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 α-淀粉酶酶解液化條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Coded values and corresponding real values of the liquification conditions tested in orthogonal array design

1.4.4 紫甘薯的糖化酶水解糖化條件研究

以1.4.3節(jié)最佳條件液化的紫甘薯液化料液為研究對象，用檸檬酸和NaOH調(diào)節(jié)pH值，加入糖化酶進(jìn)行糖化，以還原糖含量為指標(biāo)，以pH值、糖化酶添加量、時間、溫度為影響因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，其因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 糖化酶酶解糖化條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Coded values and corresponding real values of the saccharification conditions tested in orthogonal array design

1.4.5 紫甘薯酒發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.5.1 酵母菌的選擇

對于經(jīng)過α-淀粉酶液化和糖化酶糖化過的紫甘薯液，調(diào)節(jié)其pH值為4.0，然后分別接種安琪釀酒高活性干酵母、馬利酒用干酵母、法國拉曼酵母(D254)，酵母菌的添加量為0.1%，在溫度為27℃的條件下，發(fā)酵7d后，比較其酒度和花色苷含量。

1.4.5.2 料液初始pH值的確定

對于經(jīng)過α-淀粉酶液化和糖化酶糖化過的紫甘薯液，分別調(diào)節(jié)其pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，然后添加0.1%活化過的安琪釀酒高活性干酵母，在27℃條件下發(fā)酵7d后，比較其酒度和花色苷含量。

1.4.5.3 料液中酵母菌添加量的確定

對于經(jīng)過α-淀粉酶液化和糖化酶糖化過的紫甘薯液，調(diào)節(jié)其pH值為3.5，分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%活化后的安琪釀酒高活性干酵母，在溫度為27℃的條件下發(fā)酵7d后，比較其酒度和花色苷含量。

1.4.5.4 發(fā)酵溫度的確定

對于經(jīng)過α-淀粉酶液化和糖化酶糖化過的紫甘薯液，調(diào)節(jié)其pH值為3.5，添加0.1%的活化后的安琪釀酒高活性干酵母，分別在16、20、24、28、32℃溫度條件下，發(fā)酵7d后，比較其酒度和花色苷含量。

1.4.6 響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法[9-12]，選擇發(fā)酵初始pH值、酵母菌(安琪釀酒高活性干酵母)添加量和發(fā)酵溫度這3個影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以酒度為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)具體見表3。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 3 Coded values and corresponding real values of the fermentation conditions tested in Box-Behnken experimental design

1.5 指標(biāo)測定方法

1.5.1 花色苷含量測定[13]

采用消光系數(shù)法，取1mL發(fā)酵酒液用酸化乙醇(95%乙醇-1.5mol/L鹽酸體積比85:15)稀釋，靜置1h后測定A530nm和A720nm值。

1.5.2 常規(guī)指標(biāo)測定

水解度：采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》中的酸水解法；還原糖含量：采用GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法；pH值：采用pH計(jì)直接測定；酒度：采用GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的比重計(jì)法，以乙醇的體積分?jǐn)?shù)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 11.0、Excel 2007對單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Design-Expert軟件(Version 7.1 Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)對響應(yīng)面試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯的α-淀粉酶酶解液化試驗(yàn)條件優(yōu)化

表4 α-淀粉酶酶解液化條件的正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results for optimizing liquification conditions

從表4可以看出，各個因素對α-淀粉酶水解紫甘薯液的影響順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即溫度對α-淀粉酶酶解紫甘薯液的影響最大，pH值的影響最小。α-淀粉酶酶解液化紫甘薯的最優(yōu)組合為A1B1C2 D3，但是此組合在9組試驗(yàn)中未出現(xiàn)，因此需要做此組合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在此最佳組合下，水解度為90.45%，在9組試驗(yàn)中最高。故α-淀粉酶酶解紫薯的最佳條件是：紫甘薯的料液比1:1.5(m/V)、溫度65℃、水解時間2.5h、pH6.5、α-淀粉酶添加量0.15%。

2.2 紫甘薯的糖化酶酶解糖化試驗(yàn)條件優(yōu)化

表5 糖化酶酶解糖化條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5 Orthogonal array design and results for optimizing saccharification conditions

由表5可知，糖化酶酶解影響因素最大的是糖化酶添加量，其次是pH值，然后是酶解時間，最后是溫度。糖化酶酶解糖化的最佳組合為A2B3C1D3，由于該組合未在正交表中出現(xiàn)，因此需要再做此組合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此組合條件下得還原糖含量為11.35%，在9組試驗(yàn)中為最高。因此，確定糖化酶酶解糖化紫薯液的最佳條件：pH值為4.0，糖化酶添加量0.15%，酶解時間2.5h，溫度60℃。

2.3 酵母菌的確定

圖1 不同酵母菌對紫薯酒的酒度和花色苷含量的影響Fig.1 Effects of yeast type on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

紫甘薯經(jīng)2.1節(jié)和2.2節(jié)優(yōu)選出的最佳液化和糖化條件處理后，在發(fā)酵初始pH值為4.0，酵母菌添加量為0.1%，發(fā)酵溫度為27℃，發(fā)酵7d的條件下，分別采用不同品牌酵母發(fā)酵，測定發(fā)酵液的酒度和花色苷含量，結(jié)果見圖1。利用安琪釀酒高活性干酵母發(fā)酵制得的紫薯酒的酒度較高，且花色苷的含量也較高，酒香味比較純正，酸澀味和諧。

2.4 紫薯酒酵母發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)研究

2.4.1 料液初始pH值對發(fā)酵酒的酒度和花色苷含量的影響

以紫甘薯經(jīng)2.1節(jié)和2.2節(jié)優(yōu)選出的最佳液化和糖化條件處理后得到的料液為研究對象，分別調(diào)節(jié)其pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，再添加0.1%活化后的安琪釀酒高活性干酵母，在27℃的條件下發(fā)酵7d后，測定其酒度和花色苷含量，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對紫薯發(fā)酵酒的酒度和花色苷含量的影響Fig.2 Effect of pH on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

由圖2可知，料液的初始pH值為3.5時，發(fā)酵出的紫薯酒的酒度和花色苷的含量均最高。當(dāng)pH＜3.5時，隨著pH值的增加，紫薯酒的酒度逐漸升高；當(dāng)pH＞3.5時，隨著pH值的增加，紫薯酒的酒度逐漸降低。因此，料液的初始pH值以3.5為宜。

2.4.2 料液中安琪釀酒高活性干酵母添加量對發(fā)酵酒的酒度和花色苷含量的影響

圖3 安琪釀酒高活性干酵母添加量對紫薯酒的酒度和花色苷含量的影響Fig.3 Effect of added yeast amount on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

以紫甘薯經(jīng)2.1節(jié)和2.2節(jié)優(yōu)選出的最佳液化和糖化條件處理后得到的料液為研究對象，調(diào)節(jié)其pH值為3.5，分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%活化過的安琪釀酒高活性干酵母，在27℃條件下發(fā)酵7d后，測定其酒度和花色苷含量，結(jié)果見圖3。當(dāng)料液中安琪釀酒高活性干酵母的添加量為0.1%時，紫薯酒的酒度最高；當(dāng)安琪釀酒高活性干酵母的添加量＜0.1%時，隨著安琪釀酒高活性干酵母添加量的增加，紫薯酒的酒度逐漸升高；當(dāng)安琪釀酒高活性干酵母的添加量＞0.1%時，隨著添加量的增加，紫薯酒的酒度開始降低。因?yàn)楫?dāng)安琪釀酒高活性干酵母添加量小時，發(fā)酵液中的糖不能完全被安琪釀酒高活性干酵母利用轉(zhuǎn)化為酒精；安琪釀酒高活性干酵母的添加量大時，會消耗紫薯發(fā)酵液中的糖用于自身的生長，而用于生成酒精的底物量減少。而安琪釀酒高活性干酵母的添加量對紫薯酒中花色苷的含量影響不是很大。

2.4.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵酒的酒度和花色苷含量的影響

以紫甘薯經(jīng)2.1節(jié)和2.2節(jié)優(yōu)選出的最佳液化和糖化條件處理后得到的料液為研究對象，調(diào)節(jié)其pH值為3.5，添加0.1%活化過的安琪釀酒高活性干酵母，分別在16、20、24、28、32℃的溫度條件下，發(fā)酵7d后，測定其酒度和花色苷含量，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為20℃時，紫薯酒的酒度和花色苷的含量都為最高；當(dāng)溫度＜20℃時，隨著發(fā)酵溫度的增加，紫薯酒的酒度和花色苷的含量都逐漸升高；當(dāng)溫度＞20℃時，隨著發(fā)酵溫度的增加，紫薯酒的酒度開始降低，而花色苷含量也有所降低，但是變化不是很大。因?yàn)闇囟葧绊懡湍妇纳L，溫度過高時，酵母菌的發(fā)酵速度快，發(fā)酵劇烈，酵母菌衰老很快，最終生成的酒度低。

2.5 紫薯酒酵母發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)研究

2.5.1 紫薯酒酵母發(fā)酵條件的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取各個因素的水平，經(jīng)軟件Design Expert 7.0設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken experimental design and results for optimizing fermentation conditions

通過軟件分析，可以得到優(yōu)化后響應(yīng)值的動態(tài)參數(shù)方程：Y＝11.22ˉ0.47Aˉ0.51B＋1.04C＋0.35ABˉ 0.55ACˉ0.83BCˉ1.17A2ˉ1.25B2ˉ4.00C2。

2.5.2 回歸分析

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis for the fitted regression equation with alcohol degree as a function of various fermentation conditions

F檢驗(yàn)反映的是回歸模型的有效性，包括失擬性檢驗(yàn)和回歸方程顯著性檢驗(yàn)[14]。t檢驗(yàn)是對回歸模型的系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由方差分析可見，該模型的P＜0.05，表明該模型顯著；失擬項(xiàng)在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.1125＞0.05)。該方程決定系數(shù)R2＝0.9766，說明建立的模型能理解響應(yīng)值變化的97.66%，模型的擬合程度較好，模型是合適的。

由表7可以看出，A2、B2、C2對紫薯酒酒度的影響極顯著(P＜0.01)；因素C對其影響極顯著(P＜0.01)；因素B對其影響顯著(P＜0.05)；BC交互作用對其影響顯著(P＜0.05)；AB、AC交互作用對其影響不顯著(P＞0.05)。

2.5.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 pH值和安琪釀酒高活性干酵母添加量的交互作用對紫薯酒酒度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of pH and yeast dose on alcohol content of purple potato wine

圖6 pH值和溫度的交互作用對紫薯酒酒度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactiveeffects of pH and temperature on alcohol content of purple potato wine

圖7 安琪釀酒高活性干酵母添加量和溫度的交互作用對紫薯酒酒度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast dose and temperature on alcohol content of purple potato wine

由圖5～7可知，交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可以直接的反映出來，等高線的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著[15]。在交互作用對紫薯酒的酒度的影響中，安琪釀酒高活性干酵母的添加量和溫度的交互作用較為顯著。

2.5.4 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)軟件Design Expert 7.0優(yōu)化，分析得到最佳的試驗(yàn)參數(shù)：pH值為3.355、安琪釀酒高活性干酵母添加量為0.0845%、發(fā)酵溫度為20.72℃，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，測得紫薯酒的酒度為11.2°，與理論預(yù)測的最大值11.4616°基本相符，表明該模型可以很好的預(yù)測紫薯酒的發(fā)酵條件和酒度的關(guān)系。同時也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯酒發(fā)酵工藝參數(shù)的科學(xué)性和可行性。

3 結(jié) 論

3.1 確定了紫薯酒發(fā)酵料液的酶解條件，淀粉酶的酶解液化條件：料液比1:1.5、pH6.5、α-淀粉酶添加量0.15%、溫度65℃、酶解時間2.5h；糖化酶的酶解糖化條件：pH4.0、糖化酶添加量0.15%、酶解時間2.5h、溫度60℃。

3.2 通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法建立了紫薯酒發(fā)酵條件的二次多項(xiàng)式模型：Y＝11.22ˉ0.47Aˉ0.51B＋1.04C＋0.35ABˉ0.55ACˉ 0.83BCˉ1.17A2ˉ1.25B2ˉ4.00C2。并且確定了紫薯酒發(fā)酵的最優(yōu)條件：pH3.355、安琪釀酒高活性干酵母添加量0.0845%、發(fā)酵溫度20.72℃，測得紫薯酒的酒度為11.2°，與預(yù)測值(11.4616°)接近，說明了該模型可以很好的預(yù)測紫薯酒的發(fā)酵條件與酒度的關(guān)系。同時也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯酒發(fā)酵工藝參數(shù)的可行性。

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Optimization of Fermentation Conditions for Purple Potato Wine

YANG Ya-li，KAN Jian-quan*，SHEN Hai-liang，LIAO Chen，HU Yi-qiao
(Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

Purple potatoes from Dazhou, Sichuan province were used as raw material to ferment purple potato wine and the optimization of fermentation conditions was investigated by single factor experiments and response surface methodology. Gelatinized purple sweet potatoes were beaten into a slurry, liquified for 2.5 h with 0.15% α-amylase at 65 ℃ and pH 6.5, saccharified for 2.5 h with 0.15% glucoamylase at 60 ℃ and pH 4.0, and fermented for 7 days with 0.0845% Angel alcohol active dry yeast at 20.72 ℃ and pH 3.355. As a result, a novel purple potato wine of approximately 10°with a yield of 126.3% was obtained.

purple potato；purple potato wine；response surface methodology；saccharification；hydrolysis；fermentation

TS262.7

A

1002-6630(2012)03-0157-06

2011-03-28

四川省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009NZ0077)

楊雅利(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：yangyali037581@126.com

*通信作者：闞建全(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)。E-mail：ganjq1965@163.com