吳向遠(yuǎn)，丁 冬，宋桂良，付志遠(yuǎn)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

基因克隆、種子純度檢驗(yàn)、分子標(biāo)記輔助選擇育種等目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)都離不開分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展［1～4］，而分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用要以高效、快速的基因組DNA 提取為前提和保證.在植物基因組DNA 提取方法中，SDS和CTAB［5］是2種經(jīng)典有效的方法，能夠得到大量的高質(zhì)量DNA，但其提取步驟復(fù)雜、耗時(shí)。隨后產(chǎn)生了用切除的部分胚乳通過NaOH 裂解法提取基因組DNA，該方法雖然能夠達(dá)到批量樣品基因組DNA快速提取且保持種子活力的目的，但得到的DNA 無法長期保存［6］.為解決這一問題，本研究以玉米回交世代群體單粒種子胚乳和單株葉片為材料，以十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，Tris-HCl，EDTA(乙二胺四乙酸)和NaCl為主要試劑，結(jié)合電鉆和液氮研磨，分析了其提取效果，并探討了其在玉米種子純度檢驗(yàn)和分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用中的可行性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以雜交種鄭單958 及其親本自交系鄭58和昌7-2為種子純度檢驗(yàn)材料，以3000株(綜3×許178)× 許178的BC1分離群體為分子標(biāo)記分析材料.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單粒種子胚乳DNA 提取 選取96 粒干種子，超純水浸泡20 min.

2)用手術(shù)刀片輕輕剝開種皮，剝?nèi)∥⒘颗呷榉湃隤CR 板中.

3)加入100μL NaOH 溶液(0.2 mol·L-1，pH值=8.0)，蓋上與PCR 板對(duì)應(yīng)的硅膠墊，放入PCR儀中，100℃溫育15 min.

4)取出PCR 板后，加入等體積TE 溶液(pH值=2.0)并吸取上清液，冷卻10 min.

5)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖電泳檢測或直接用于PCR 擴(kuò)增;不用時(shí)用保鮮膜密封于4℃冰箱保存(不能超過14 d).

1.2.2 單葉片DNA 提取

1)取微量玉米葉片于2.0 mL的離心管中，用系有細(xì)繩的小夾子夾住離心管管蓋，放入液氮缸中速凍5 s.

2)迅速從液氮缸中提出離心管，用插有玻璃棒的電鉆將離心管中冷凍的葉片迅速研磨成粉末(速度要快，以防降解).

3)加入800μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%SLS 提取液(100 g·L-1SLS，0.2 mol·L-1EDTA，1 mol·L-1NaCl，1 mol·L-1Tris-HCl)，充分混勻(2～5 min).

4)加入1 mL的V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，充分混勻(2～5 min).

5)10000 r·min-1離心5 min，取上清液于1個(gè)新的2 mL 離心管中.

(6)向上清液中加入與上清液等體積預(yù)冷的異丙醇，沉淀DNA.

(7)10000 r·min-1離心5 min，棄上清液，并用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌DNA.

(8)DNA 干燥后用滅菌水溶解.

(9)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖電泳檢測或直接用于PCR 擴(kuò)增.

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 反應(yīng)總體積15μL，包括10×PCR Buffer(含20 mol·L-1Mg2+)1.5μL，NTPs(2.5 mmol·L-1)0.3μL，Taq 酶(5 U·μL-1)0.1μL，引物(50 mg·L-1)1.5μL，DNA(20 mg·L-1)3.0μL，ddH2O 8.6μL.反應(yīng)液混合后，用20μL的石蠟油覆蓋，以防反應(yīng)液蒸發(fā).PCR 擴(kuò)增程序?yàn)镻CR 反應(yīng)在PTC-200PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行.

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，65℃(-1℃/cycle)退火1 min，72℃延伸1.5 min共7個(gè)循環(huán);95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共28個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，待溫度降至4℃時(shí)取出.擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染程序參考李曉輝等［8］的方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 樣品凝膠電泳檢測

基因組DNA 提取后，在NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 核酸測定儀上測定DNA 質(zhì)量濃度.2種方法提取的樣品DNA的A260/A280比值均為1.8～2.0，在260 nm 處的吸收峰曲線穩(wěn)定，粗提的DNA 得率在250～400 mg·L-1.在瓊脂糖凝膠上對(duì)提取的DNA 進(jìn)行電泳檢測，NaOH 裂解法(圖1)對(duì)玉米單粒種子胚乳的DNA 提取效果較十二烷基肌氨酸鈉法對(duì)玉米葉片的DNA 提取效果(圖2)稍差，雜質(zhì)較后者多，但2種方法得到的基因組DNA 均有清晰的主帶，對(duì)普通的SSR 反應(yīng)都有效.

圖1 NaOH 裂解法提取的玉米子粒胚乳DNAFig.1 Electrophoresis map of amplified DNA from maize endosperm

2.2 單粒種子胚乳NaOH 裂解法和改良SLS 法所得DNA 應(yīng)用的比較

用單粒種子胚乳NaOH 裂解法快速提取玉米雜交種鄭單958 及親本自交系鄭58和昌7-2的DNA，并利用自己保存的SSR 引物，選取了在親本間有遺傳多態(tài)性的2 對(duì)引物phi 116和bnlg 1450對(duì)鄭單958 雜交種的純度進(jìn)行了檢測(圖3).無論在雜交種中，還是親本中，2 對(duì)引物擴(kuò)增條帶都十分清楚，完全可以達(dá)到檢驗(yàn)種子純度的目的.

同理，對(duì)采用改良SLS 法提取的(綜3× 許178)×許178的BC1回交群體DNA 進(jìn)行了標(biāo)記分析，篩選了在綜3和許178 間存在多態(tài)性的SSR 標(biāo)記.圖4為引物bnlg 1191 對(duì)BC1回交群體檢測的部分單株DNA分子帶型.由圖4可見，回交群體個(gè)體間的多態(tài)性分離明顯，目的條帶清晰，完全可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的要求.

3 討論

目前，SSR 標(biāo)記技術(shù)已被用于種質(zhì)鑒定、種子純度分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及標(biāo)記輔助選擇等研究領(lǐng)域［7～9］.無論是鑒定，還是對(duì)分離群體目標(biāo)性狀及時(shí)的前期選擇，都涉及批量、大規(guī)模樣本基因組DNA的提取［10，11］.如何高效、快速地提取基因組DNA 已成為分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于玉米育種研究的首要限制因素.本研究為探索解決這一問題的途徑，對(duì)已有的從玉米單粒種子胚乳中提取DNA的方法［12，13］進(jìn)行了優(yōu)化，并提出了從玉米單葉片中快速提取玉米基因組DNA［14］的改良實(shí)用方法.與傳統(tǒng)CTAB 法和SDS 法相比，本研究所用的2種方法都用電鉆粉碎取代了手工研磨，節(jié)約了勞動(dòng)力和成本.盡管SLS 比SDS 價(jià)格高，但該方法步驟簡單，節(jié)約了時(shí)間，提高了效率，比傳統(tǒng)方法的提取效率提高了2～3倍，1 d 內(nèi)可提取600～800份樣品的DNA.與傳統(tǒng)方法相比，NaOH 裂解法同樣可以達(dá)到快速提取基因組DNA的目的.用NaOH 裂解法提取玉米單粒種子胚乳DNA 僅有簡單的2 步，1 人·d-1很容易提取1000份，尤其遇到圖位克隆中涉及大群體樣品DNA 提取時(shí)，該方法更為高效、快捷.但與SLS 法相比，該方法提取的基因組DNA 不易于長期保存，也無法用于后續(xù)的DNA 純化和測序工作.盡管2種方法各有優(yōu)點(diǎn)，但是都可以作為目前最經(jīng)濟(jì)、高效、便捷的DNA 提取方法，可以有效滿足玉米品種純度鑒定和分子標(biāo)記輔助育種的需求.

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