廣西人口和計(jì)劃生育研究中心 莫 毅

廣西畜牧研究所 梁方方＊ 賴志強(qiáng) 盧玉發(fā) 廖玉英 何仁春 黃麗霞

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 楊 琳

木聚糖酶能夠降解飼料中的木聚糖，提高飼料利用率，降低畜禽腸道內(nèi)飼料的黏度，從而提高飼料的有效能值和改善動(dòng)物消化道的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)（張曉暉等，2007）。但由于從自然環(huán)境中篩選所獲得的木聚糖酶產(chǎn)生菌存在產(chǎn)量低，木聚糖酶不易分離純化、穩(wěn)定性差、不同來源的酶適應(yīng)性不同等不足，在一定程度上限制了木聚糖酶的動(dòng)物飼料添加劑中的實(shí)際應(yīng)用 （阮同琦等，2008；陳叢瑾等，2007）。

畢赤酵母 （Pichia pastoris）是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)不僅克服了原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物不易分離純化和不能保持重組蛋白活性等缺點(diǎn)，且可對(duì)翻譯后的蛋白進(jìn)行適度糖基化修飾、折疊、加工，使生產(chǎn)的蛋白具有天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性（Anjali等，2009；Su 等，2007）。 此外，畢赤酵母具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，外源蛋白的表達(dá)基因操作簡(jiǎn)單、外源蛋白能正確加工與修飾、表達(dá)量高、易大量發(fā)酵培養(yǎng)、內(nèi)源性蛋白分泌少和易純化等優(yōu)點(diǎn)，使得畢赤酵母成為目前應(yīng)用較廣的分泌型真核表達(dá)系統(tǒng)（Cereghino和 Cregg，2000）。本文通過將編碼枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis strain GD3b）木聚糖酶（Xyn B）基因，克隆到 pPICZa A載體中，構(gòu)建分泌型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa-Xyn B，重組質(zhì)粒經(jīng)線性化轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33，經(jīng)篩選獲得可分泌表達(dá)Xyn B重組蛋白的畢赤酵母工程菌 X-33/Xyn B（莫毅等，2011）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 大腸桿菌株E.coli.DH5a，畢赤酵母菌株X-33和重組質(zhì)粒pUC-Xyn B由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pPICZa A購于Invitrogen公司。

1.1.2 試劑 T4DNA連接酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶Sac I、EcoR I和Xba I均購于TaKaRa大連寶生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA磁珠購于法瑪西亞公司；Zeocin、YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基見Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)（Invitrogen，2008）；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B的構(gòu)建 將pUC-Xyn B重組質(zhì)粒中的Xyn B基因片段和pPICZa A載體使用EcoR I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物有限公司）純化后，按照Xyn B：pPICZa A數(shù)量比為3∶1取樣混合，通過T4DNA連接酶4℃連接過夜；次日，取5 μL連接混合液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli.DH5a，經(jīng)復(fù)蘇后，在 LB（Zeocin 25 μg/mL）平板上涂板，過夜培養(yǎng)。陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xba I雙酶切鑒定。鑒定正確后，菌液委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選 以LiCl法將Sac I線性化的重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌X-33，轉(zhuǎn)化物涂布于YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板，30 ℃培養(yǎng) 3 d。 將平板上的轉(zhuǎn)化子分別于新的YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板上劃線接種，30℃培養(yǎng)3～5 d以獲得較多的轉(zhuǎn)化菌。

以pPCIZa A表達(dá)載體AOX引物AOX F：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，AOX R：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，挑取 7 株轉(zhuǎn)化菌裂解為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（莫毅等，2011）。退火溫度為58℃，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 Xyn B重組蛋白表達(dá)檢測(cè) 經(jīng)PCR鑒定后，挑取菌落水解圈最大的陽性轉(zhuǎn)化子X-33/Xyn B轉(zhuǎn)接于搖瓶進(jìn)行擴(kuò)培。取擴(kuò)培后的菌株接種于10 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。離心收集菌體，再將其懸浮于250 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，約5 d取2.5 mL上清液與10 μL Ni-NTA磁珠混合，旋轉(zhuǎn)振蕩過夜；次日，離心收集Ni-NTA磁珠，并用PBS緩沖液洗滌3次，加入蛋白上樣緩沖液制樣進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B的構(gòu)建 由圖1可見，重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B經(jīng)雙酶切鑒定得到2條特異性條帶，分別與目的基因片段（642 bp）和線性pPICZa A載體（3600 bp）大小一致，表明Xyn B已定向插入表達(dá)載體pPICZa A中。重組質(zhì)粒同時(shí)送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，結(jié)果表明，插入的基因片段全長(zhǎng)642 bp，讀碼框正確。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B雙酶切鑒定

2.2 重組畢赤酵母X-33/Xyn B的篩選 7個(gè)重組畢赤酵母菌基因組使用AOX引物，經(jīng)PCR鑒定結(jié)果見圖2。由圖2可見，7個(gè)重組菌均擴(kuò)增出一特異性條帶，與目的基因片段 （639 bp）+pPICZa A AOX測(cè)序區(qū)域（580 bp）大小一致，結(jié)果說明，所挑選的7個(gè)重組畢赤酵母菌基因組中已整合了Xyn B基因。

2.3 Xyn B重組蛋白表達(dá)檢測(cè) 由圖3可見，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)得到明顯的蛋白表達(dá)帶，與重組Xyn B融合蛋白35.1 kDa大小相符（Xyn B基因的理論分子質(zhì)量23.3 kDa+9.3 kDa的a信號(hào)肽+2.5 kDa的C末端標(biāo)簽），說明SDS-PAGE電泳已檢測(cè)到了Xyn B的融合蛋白表達(dá)；此外，在45 kDa后還有一條較明顯的條帶，分子質(zhì)量大于Xyn B融合蛋白的理論值，此結(jié)果與韓雙艷等（2009）研究報(bào)道的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶Xyn重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白分子質(zhì)量大于理論分子質(zhì)量的結(jié)果相似。可能與木聚糖酶蛋白序列存在6個(gè)N糖基化位點(diǎn)，2個(gè)O糖基化位點(diǎn)，重組蛋白表達(dá)過程中部分蛋白糖基化而引起的分子量偏大。而其他的雜帶有可能是菌體本身的表達(dá)蛋白，分子量小，且量不多，可直接通過選擇合適孔徑的超濾管進(jìn)行篩選，便于目的蛋白的純化。

3 結(jié)論

分泌型酵母表達(dá)載體pPICZa A具有信號(hào)肽基因a-factor和甲醇誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子AOX。afactor信號(hào)肽可幫助外源蛋白順利的分泌到細(xì)胞外，方便了產(chǎn)物的檢測(cè)和純化；甲醇氧化酶啟動(dòng)子是強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，利于通過甲醇的誘導(dǎo)強(qiáng)化外源基因表達(dá)。 本研究選用pPICZa A作為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZa-Xyn B，篩選到能夠成功表達(dá)Xyn B重組融合蛋白的畢赤酵母X-33/Xyn B，為進(jìn)一步研究重組木聚糖酶的酶學(xué)特性，開發(fā)優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

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