姚軍 張佳麗

（福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 兒童牙科，福州 350002）

赤蘚糖醇是一種具有極低熱量值[1]的糖醇類食品，目前對赤蘚糖醇的研究多集中在其低熱量、高耐受性等方面，還未將赤蘚糖醇廣泛的應用于防治齲病方面。國內(nèi)外研究表明：赤蘚糖醇可以抑制變異鏈球菌的生長[2-4]，具有防齲的作用[5]。但關(guān)于赤蘚糖醇對變異鏈球菌的抑菌機制尚未完全明了。本實驗通過測定在蔗糖和赤蘚糖醇條件下變異鏈球菌所在的液體培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性，以及在掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察赤蘚糖醇作用后變異鏈球菌表面的形態(tài)變化，了解赤蘚糖醇對變異鏈球菌表面結(jié)構(gòu)的影響，從而探討赤蘚糖醇的抑菌機制。

1 材料和方法

1.1 菌株和主要試劑

變異鏈球菌國際標準株ATCC25175（四川大學華西口腔醫(yī)學院齲病研究室惠贈），雙蒸水（福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院中心實驗室制造），蔗糖（分析純，分子式C12H22O11，相對分子質(zhì)量為342.29，廣東省化學試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心），赤蘚糖醇（分子式C4H10O4，相對分子質(zhì)量為122.12，山東省保齡寶生物股份有限公司），木糖醇（分子式C5H12O5，相對分子質(zhì)量為152.15，天津市福晨化學試劑廠）。TPY液體培養(yǎng)基（1.5%胰蛋白胨、0.4%酵母提取物、1%葡萄糖、0.6%磷酸二氫鉀、0.2%碳酸鈉、0.2%氯化鈉、0.2%磷酸氫二鉀、雙蒸水）調(diào)節(jié)pH值到7.0，高壓滅菌。TPY固體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基中加入1.25%瓊脂）高壓滅菌。

1.2 主要實驗儀器

厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），SEM（飛利浦公司，荷蘭），臺式冷凍高速離心機（Heraeus公司，德國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 變異鏈球菌的復蘇和純化 將在甘油中保存的變異鏈球菌標準株接種至TPY固體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧（80%N2、10%CO2、10%H2）條件下培養(yǎng)24 h。取上述復蘇的標準株單個菌落接種于TPY固體培養(yǎng)基內(nèi)，相同條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 LDH活性測定 將實驗分為蔗糖組、木糖醇組和赤蘚糖醇組，濃度均為8%，每組3個試管。各取200μL菌液分別加入含上述成分的TPY液體培養(yǎng)基（各20mL）中，各組均置入37℃厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2、10%H2）中培養(yǎng)24 h后，3 500·min-1離心10min，用微孔濾膜（0.22μm）過濾除去細菌后取其上清液，用全自動生化分析儀分別測定各個試管上清液中LDH的活性，其原理是基于酶對光的選擇性吸收，即分光光度法。酶的活性用光密度值來表示，也反映了各試管中酶的濃度。

1.3.3 蔗糖和赤蘚糖醇作用前后變異鏈球菌形態(tài)學的SEM觀察 將實驗分為2組，分別為8%蔗糖組和8%赤蘚糖醇組，細菌的培養(yǎng)條件如上。在試管中放入1 cm×1 cm大小的蓋玻片，每管加入菌液100μL及添加有蔗糖或赤蘚糖醇的TPY培養(yǎng)基4mL。在37℃厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2、10%H2）中培養(yǎng)8 h后，小心棄菌液，取出蓋玻片，2%戊二醛固定1 h，乙醇梯度脫水30min[6]，干燥，噴金，SEM下觀察細菌形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，對以上結(jié)果進行多樣本均數(shù)多重比較的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 赤蘚糖醇對變異鏈球菌LDH的影響

變異鏈球菌分別在蔗糖、木糖醇和赤蘚糖醇的TPY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，上清液中LDH的含量分別為（0.2±0.1）、（3.2±0.1）、（3.2±0.1）IU·L-1。在蔗糖組，上清液中LDH的量與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但這種差異在臨床實驗中卻很小；木糖醇組與赤蘚糖醇組相比較，上清液中LDH的量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 蔗糖和赤蘚糖醇作用前后變異鏈球菌形態(tài)學的SEM觀察結(jié)果

在蔗糖和赤蘚糖醇作用后，SEM下觀察變異鏈球菌的表面形態(tài)結(jié)果見圖1、2。由圖1、2可見，在5000倍鏡下，蔗糖組細菌分布總體較稠密，有部分區(qū)域呈團塊狀，赤蘚糖醇組細菌分布總體較為稀疏。在10 000、20 000倍鏡下，蔗糖組和赤蘚糖醇組中均可見變異鏈球菌外形清晰，細菌表面光滑，無缺損，沒有內(nèi)容物溢出的跡象。

3 討論

赤蘚糖醇的防齲功能已經(jīng)被初步證實，其抑制變異鏈球菌的作用也已經(jīng)得到初步的肯定，但關(guān)于其抑菌機制尚未完全明了，可以從以下幾個方面推測考慮。

3.1 對細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)的影響

細胞壁和細胞膜都是細菌的重要結(jié)構(gòu)，細胞壁能維持細胞的正常形態(tài)和進行物質(zhì)交換，保持細胞內(nèi)的高滲壓；而細胞膜位于細胞壁內(nèi)層，由脂質(zhì)雙分子層和蛋白質(zhì)組成，具有滲透屏障和選擇性物質(zhì)運輸?shù)裙δ?。一旦細胞壁和細胞膜的完整性遭到破壞，細胞?nèi)容物就會大量溢出，所以可以用細菌的培養(yǎng)上清液中細胞內(nèi)酶的含量來作為判斷細胞壁和細胞膜是否完整的一個重要的指標。

LDH是變異鏈球菌等細菌內(nèi)的固有酶，該酶總以高濃度存在于細胞內(nèi)，是變異鏈球菌代謝過程中一種重要的酶。LDH可以通過其催化作用，調(diào)節(jié)菌斑酸的代謝，維持菌斑生態(tài)平衡，并對抗由環(huán)境中糖濃度突然增加而引起的菌細胞死亡[7]。因為這些酶主要存在于細胞內(nèi)，而在培養(yǎng)基內(nèi)較少，所以本實驗通過測定變異鏈球菌培養(yǎng)上清液中LDH的濃度來判定赤蘚糖醇對該細菌細胞壁以及細胞膜的影響。實驗結(jié)果顯示：加入赤蘚糖醇后培養(yǎng)上清液中LDH的濃度比加入蔗糖時高，但這種差異很小，在臨床實驗中幾乎可以忽略，這提示只有極少量變異鏈球菌的細胞壁和細胞膜的完整性被破壞。掃描電鏡下也見在蔗糖或赤蘚糖醇條件下，大多數(shù)變異鏈球菌的表面形態(tài)并沒有很大的不同，細菌表面光滑，無缺損，并沒有看見有內(nèi)容物的溢出?？梢酝茰y，赤蘚糖醇對變異鏈球菌的抑制作用主要不是通過對變異鏈球菌細胞壁或者細胞膜的直接破壞來實現(xiàn)的。

3.2 干擾細菌內(nèi)正常的生理代謝

根據(jù)木糖醇抑制細菌作用的機制來推測其抑菌機制主要為以下幾個方面：首先變異鏈球菌的磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvic acid-phosphotransferase system，PEP-PTS）可以將赤蘚糖醇轉(zhuǎn)移至細菌體內(nèi)，同時對該酶的占用也抑制了細菌對葡萄糖的吸收轉(zhuǎn)運。其次，赤蘚糖醇在細菌體內(nèi)被磷酸化的產(chǎn)物堆積，抑制變異鏈球菌的生長。再次，赤蘚糖醇可能會在細菌體內(nèi)產(chǎn)生“磷酸—脫磷酸”這種無效的循環(huán)，導致大量的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid，PEP）被消耗，而PEP是合成三磷酸腺苷的原料和PEP-PTS系統(tǒng)的能量來源，這就導致了細菌生長的抑制。最后可以從分子生物學角度探究。研究發(fā)現(xiàn)：木糖醇可以干擾變異鏈球菌的蛋白合成及熱休克蛋白-60、70的表達，進而影響變異鏈球菌的生長[8]。還可從對變異鏈球菌分子蛋白合成影響方面來探索赤蘚糖醇的抑菌機制。

3.3 阻止其他營養(yǎng)物質(zhì)進入菌體

赤蘚糖醇的存在抑制了變異鏈球菌對葡萄糖的轉(zhuǎn)運吸收，因為其占用了轉(zhuǎn)運葡萄糖的轉(zhuǎn)移酶。另一方面當葡萄糖被吸收時，易被變異鏈球菌的特異性葡糖基轉(zhuǎn)移酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為胞外多糖，形成葡聚糖和果聚糖。其中不溶性葡聚糖具有黏性，能抵抗口腔細菌的降解，是構(gòu)成菌斑基質(zhì)的主要成分。它能促進細菌在牙面的集聚，促進菌斑的形成。而且其可以改變菌斑的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，使菌斑成為多孔性結(jié)構(gòu)，有利于葡萄糖溶液滲透進入菌斑-釉質(zhì)交界面并被細菌發(fā)酵產(chǎn)酸，增加菌斑的致齲性[9]。赤蘚糖醇不能被利用產(chǎn)生不溶性葡聚糖，也就不能形成這種多孔性的結(jié)構(gòu)，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的進入。

赤蘚糖醇對變異鏈球菌的抑制機制還處在初步探索階段，本實驗只是初步證明赤蘚糖醇對變異鏈球菌細胞壁和細胞膜并沒有很強的破壞作用，其具體的抑菌機制還需更深入的探討研究。

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