張 華

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

癌癥已成為人類致死的首要病因。目前臨床放化療藥物效果皆不夠理想。用中藥治療癌癥［1-3］，不僅能扶正抗癌，且能針對(duì)性的治療癌癥，恢復(fù)受損的臟器功能，收到良好效果。蟾灰膠囊為驗(yàn)方制劑，由干蟾皮、灰樹花、人參、全蝎等藥材組成，是一劑療效突出的扶正抗癌藥。參考相關(guān)文獻(xiàn) ［4-6］，現(xiàn)對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行探討，為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LabAlliance高效液相色譜儀;Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)柱。FA1104型電子分析天平 (上海精密科學(xué)儀器有限公司);ZF—2型三用紫外分析儀 (上海安亭電子儀器廠)。

1.2 對(duì)照品與供試品 人參皂苷Rg1(ginsenoside批號(hào)110703-200424);華蟾酥毒基 (cinobufagin批號(hào) 110803-200504);脂蟾毒配基 (resibufogenin批號(hào)110718-200507)，均購自中國藥品生物制品檢定所。蟾灰膠囊 (自制)。灰樹花、干蟾皮、全蝎、人參均符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.3 試劑 硅膠G(薄層色譜用，青島海洋化工有限公司，批號(hào)20051056);甲醇色譜純 (天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)070515101)其余試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1干蟾皮鑒別［6-7］取內(nèi)容物粉末5.0 g，加乙醇60 mL，回流30 min，濾過，濾液置5 mL量瓶加乙醇至刻度，通過D101大孔樹脂柱，先用水洗脫至無色，棄水洗液;再用30%乙醇洗至無色，棄30%乙醇洗脫液;后用乙醇洗脫，收集洗脫液100 mL，水浴揮干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，為供試品溶液。取干蟾皮藥材，同法制備陽性對(duì)照液。取華蟾酥毒基對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (附錄ⅦB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10、10、6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮 (4∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 干蟾皮薄層鑒別

2.2 人參鑒別［8-11］取內(nèi)容物細(xì)粉5 g，研細(xì)，用硅藻土分散，加甲醇20 mL，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)盟芙?，移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取，萃取液?倍氨試液，振搖，放置分層，取上清液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解。取人參皂苷 Rg1對(duì)照品制成0.24 mg/mL的對(duì)照液。取上述溶液各8、4 μL分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (15∶40∶20∶10)10℃放置后的下層液，展開，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 人參的鑒別

3 定量測定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的制備 精密稱取減壓干燥24 h的脂蟾毒配基1.60 mg，華蟾酥毒基1.82 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL，從中精取0.1 mL稀釋至1 mL，得對(duì)照品溶液。

3.2 供試液的制備［6-7］取3批膠囊內(nèi)容物研細(xì)，約10 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL精密稱定，回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，微孔濾膜濾過，即得。

3.3 色譜條件［6-7］以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑;以0.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈 (50∶50)(用磷酸調(diào)pH值3.2)為流動(dòng)相，體積流量1 mL/min，檢測波長為296 nm，柱溫40℃，理論板數(shù)按脂蟾毒配基峰計(jì)算不低于4 000。

3.4 定量測定方法學(xué)考察［12］

3.4.1 專屬性試驗(yàn) 陰性對(duì)照液的制備，取除干蟾皮外的三味藥材，同本制劑制備方法制備陰性顆粒，同供試液的制備方法制備陰性對(duì)照液。

取陰性對(duì)照液及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，分別在測定的條件下進(jìn)樣，結(jié)果在與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)部位，陰性對(duì)照液無色譜吸收峰，表明該方法專屬性良好，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖3。

3.4.2 線性關(guān)系及線性范圍 取不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液分別進(jìn)樣50 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖并線性回歸，得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=25 735 876.5X+23 179.5，r=0.999 9，和Y=312 973 96X+12 656，r=0.999 5，表明兩者質(zhì)量濃度在0.003 2～0.32 mg/mL和0.003 64～0.364 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

3.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算脂蟾毒配基和華蟾酥毒基RSD分別為1.8%和1.9%，表明儀器精密度良好。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精制后的供試液，分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣1次，測定，計(jì)算脂蟾毒配基和華蟾酥毒基RSD分別為2.0%和2.2%，說明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖3 陰性對(duì)照液 (A)、對(duì)照品 (B)和樣品 (C)HPLC色譜圖

3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品，按照3.2項(xiàng)下方法精制供試液6份，分別測定，計(jì)算脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的含量，RSD分別為1.6% 和1.7%，說明重復(fù)性良好。

3.4.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的樣品約5 g，精密稱定，共6份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品0.8 mL、0.6 mL質(zhì)量濃度為0.32 mg/mL和0.364 mg/mL的脂蟾毒配基及華蟾酥毒基標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，按3.2項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1、表2。表明測定結(jié)果可靠。

表1 脂蟾毒配基回收率考查結(jié)果

表2 華蟾酥毒基回收率考查結(jié)果

3.5 蟾灰膠囊樣品測定 取供試液，進(jìn)樣50 μL，測定并計(jì)算樣品華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測定結(jié)果見表3。

3批樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.052 9 mg/g和0.051 2 mg/g，考慮到干蟾皮有一定的毒副作用，擬定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.046～0.058 mg/g。

4 討論

蟾灰膠囊中人參，蟾皮均有獨(dú)特的顯色斑點(diǎn)。干蟾皮鑒別樣品液的精制方法開始借鑒2010年版《中國藥典》蟾酥項(xiàng)下鑒別方法，結(jié)果背景干擾很大，經(jīng)改進(jìn)后有好轉(zhuǎn)，能較好達(dá)到鑒別的目的?；覙浠ê腿两駴]有找到專屬性好的鑒別方法，暫不對(duì)這兩味藥進(jìn)行鑒別。

表3 蟾灰膠囊測定結(jié)果

脂蟾毒配基與華蟾酥毒基的高效液相吸收峰相鄰但能達(dá)到較好的分離，可同時(shí)測定兩種成分的含有量。測定方法快速便捷，方法學(xué)考查結(jié)果表明能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。根據(jù)研究結(jié)果，暫定本品含脂蟾毒配基和華蟾酥毒基在0.046～0.058 mg/g范圍內(nèi)。

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