余曉曦 孟凌華 余奇文 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，上海200025)

CD8+CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞是一類具有細(xì)胞毒作用的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在抗腫瘤免疫等方面發(fā)揮重要作用。腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療是將從個(gè)體中分離獲取的淋巴細(xì)胞經(jīng)體外刺激，通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能后，回輸人體發(fā)揮抗腫瘤作用，其關(guān)鍵是如何在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞快速增殖并達(dá)到理想的效應(yīng)細(xì)胞組成格局?；ㄇ嗨?Anthocyanidin)又稱花色素，基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃型陽離子，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖形成各種花色苷而廣泛存在于藍(lán)莓、葡萄、紫甘薯、黑加侖、胡羅卜、紫蘇和紅甘藍(lán)等植物中，發(fā)揮抗氧化作用［1］?；ㄇ嗨鼐哂性鰪?qiáng)免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長、保護(hù)肝臟以及有效減輕由氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷等作用［2，3］。我們從紫蘇葉中提取花青素的有效成分紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷，刺激誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞，觀察 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及NKT細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖格局的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 湖北紫蘇葉，由本院藥化教研組提供;人參皂苷Rh2，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;熒光標(biāo)記抗體:CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC cocktail、CD56-FITC、Va24-Ja18-TCR-PE，eBioscience產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco產(chǎn)品;LymphoprepTM(1.077 ±0.001)g/ml，Norway產(chǎn)品;rIL-2，上海華新生物制品公司產(chǎn)品;rINF-γ，Quantikine產(chǎn)品;抗人CD3單克隆抗體，由上海市免疫學(xué)研究所提供;人AB型血清，由上海市血液中心提供。

1.2 主要儀器 制備型HPLC(Agilent1200);分析型HPLC(Agilent1100);FACS-Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.3 紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷分離提取取湖北省野生半紅紫蘇葉82.3 g，以50 mmol/L硫酸-50%甲醇溶液于室溫下低速攪拌浸泡，浸出物用等體積乙酸乙酯作液液萃取，水相萃取物以配備Kromasil C18 柱(粒徑5 μm，21.2 ×250 mm)的 Agilent1200制備型液相色譜進(jìn)行分離，流動相A為2%甲酸/水、B為甲醇，流速10 ml/min，甲醇比例在50分鐘內(nèi)由40%增至70%梯度洗脫。

1.4 紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷鑒定 分離產(chǎn)物經(jīng)Agilent1100 HPLC分析，采用Kromasil C18柱(粒徑5 μm，4.6 ×250 mm)，VWD 可變波長檢測器，檢測波長分別為325 nm和530 nm，流動相A為4%甲酸/水，B為4%甲酸/乙腈，流動相A在0到60分鐘內(nèi)由94%變化到78%，流速0.8 ml/min。

1.5 細(xì)胞刺激培養(yǎng) 取2支抗CD3單克隆抗體，以20 ml生理鹽水溶解制成包被液，0.22 μm過濾器除菌，然后加至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔400 μl，置4℃冰箱過夜，次日棄去包被液備用。取正常人肝素抗凝靜脈血，用培養(yǎng)液對倍稀釋，用 LymphoprepTM，2 000 r/min，20 分鐘分離單個(gè)核細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并以含有10%AB型人血清、1 000 U/ml IL-2、1 000 U/ml IFN-γ 的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105ml-1，加入到包被有CD3單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔600 μl，3復(fù)孔。分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組刺激物分別為紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA、人參Rh2等。PHA為1%、0.1%和0.01%3種濃度，其他刺激物均為 100、10、1.0 μg/ml 3 種濃度。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換半液，于第4、7天取細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體染色，F(xiàn)ACS檢測。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型 取1×105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，用1%FBS-PBS洗滌，洗滌后細(xì)胞懸浮于100 μl 1%FBS-PBS，加入熒光抗體，室溫避光培養(yǎng)30分鐘，洗3次，上FACS儀檢測CD3+T細(xì)胞數(shù)、CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD8+T細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞數(shù)以及NKT細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間樣本采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用x±s表示，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷提取與鑒定結(jié)果 從82.30 g紫蘇葉中分離提取得到0.33 g紫蘇寧和0.35 g矢車菊素3，5-二葡萄糖苷，經(jīng)鑒定與國外實(shí)驗(yàn)HPLC峰譜一致［4］。從圖1可見紫蘇寧(A1)在波長325 nm和530 nm下幾乎無雜質(zhì)峰，達(dá)到了較高的純度，在近52分鐘時(shí)形成波峰;矢車菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)在波長325 nm和530 nm下有少量雜質(zhì)峰，在18分鐘附近形成波峰。

2.2 不同濃度紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷對免疫效應(yīng)細(xì)胞的刺激 以①100 μg/ml、②10 μg/ml、③1.0 μg/ml 3 種濃度的紫蘇寧、矢車菊素 3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周淋巴細(xì)胞，刺激7天以后免疫效應(yīng)細(xì)胞組成格局變化見表1。

圖1 紫蘇寧(A1)和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)HPLC鑒定圖譜Fig．1 Identification of Shisonin(A1)and Cyanidin(A2)with HPLC

2.3 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷與PHA和人參皂苷Rh2刺激比較 以紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷以及人參Rh2濃度均為10 μg/ml，PHA濃度為1%，經(jīng)4天刺激誘導(dǎo)正常人外周淋巴細(xì)胞以后免疫效應(yīng)細(xì)胞組成格局變化見表2。矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD8+T和NK細(xì)胞增殖具有顯著上調(diào)作用(P＜0.05);PHA對CD8+、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞增殖具有顯著上調(diào)作用(P＜0.01～0.05);人參Rh2對NKT細(xì)胞增殖具有顯著上調(diào)作用(P＜0.01)。

表1 不同濃度的紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖格局的作用(%，x±s)Tab．1 Change of immunologic effector cells stimulated by different concentrations of Shisonin and Cyanidin(%，x±s)

表2 不同刺激物對免疫效應(yīng)細(xì)胞格局的作用比較(%，x±s)Tab．2 Effect of different stimulus to the pattern of immunologic effector cells(%，x±s)

2.4 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷等刺激不同時(shí)間后結(jié)果比較 以紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA和人參Rh2等刺激淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4天與7天，比較各刺激物對免疫效應(yīng)細(xì)胞的持續(xù)刺激效應(yīng)。紫蘇寧對CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞的刺激后細(xì)胞增殖百分率自第4天到第7天分別為:49.81±4.42(%)到62.75±5.24(%);25.55±1.56(%)到70.32±5.15(%);0.38±0.12(%)到1.51±0.22(%)，均呈上升趨勢(P＜0.05)。矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD8+T細(xì)胞刺激后細(xì)胞增殖百分率自第4天到第7天為38.51±2.34(%)到63.03±4.42(%)，呈上升趨勢(P＜0.01)。PHA和人參Rh2在第4天到第7天未見持續(xù)性刺激效應(yīng)。

3 討論

在腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療中，需要回輸大量具有殺腫瘤效應(yīng)的淋巴細(xì)胞。為了快速、經(jīng)濟(jì)地誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖，本實(shí)驗(yàn)以紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周單個(gè)核細(xì)胞，刺激培養(yǎng)4、7天以后觀察其T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞以及NKT細(xì)胞的刺激增殖作用，結(jié)果顯示紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖作用呈現(xiàn)隨刺激物濃度升高而增強(qiáng)的趨勢，矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對NK細(xì)胞具有刺激生長作用，而紫蘇寧與矢車菊素3，5-二葡萄糖苷等比例混合沒有發(fā)揮互補(bǔ)的刺激作用，初步證實(shí)了紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷具有誘導(dǎo)CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖的作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長會導(dǎo)致其活力下降，紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷可以抵抗自由基對脂肪、蛋白質(zhì)和核酸的氧化性損害，實(shí)驗(yàn)顯示紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對細(xì)胞的刺激增殖作用隨時(shí)間延長而更顯見。但是紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷在免疫細(xì)胞培養(yǎng)中的作用是刺激細(xì)胞增長還是抗氧化保護(hù)或兼而有之尚待進(jìn)一步證實(shí)。

PHA是人T淋巴細(xì)胞非特異性促有絲分裂原，可用于制備CD3AK細(xì)胞［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)1%PHA刺激4天后，NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組，7天以后，CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)逐漸降低。說明PHA在短期內(nèi)可以刺激細(xì)胞生長，尤其是NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞，長期刺激對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖的效果卻遜于紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷。人參皂苷Rh2具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)和調(diào)節(jié)免疫功能的作用［6-8］。以Rh2作為刺激物，對單個(gè)核細(xì)胞4天誘導(dǎo)培養(yǎng)后可以明顯刺激NKT細(xì)胞增殖(P＜0.01)，7天則可以刺激CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞增殖。2個(gè)時(shí)間段未見對NK細(xì)胞有誘導(dǎo)作用。NKT細(xì)胞是一種特定的異質(zhì)性T細(xì)胞亞群，兼有NK細(xì)胞和T細(xì)胞的某些特征。NKT細(xì)胞在發(fā)揮殺傷作用時(shí)不受MHC限制，激活的NKT細(xì)胞可以釋放大量細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體抗感染和抗腫瘤的作用［9，10］。本文初步證明人參皂苷Rh2對CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞具有增殖效應(yīng)。以花青素、PHA、人參Rh2組合取代細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞不僅有效且更經(jīng)濟(jì)，具有良好的應(yīng)用前景。

過繼性細(xì)胞免疫治療還須考慮Treg細(xì)胞、γδT細(xì)胞、DC細(xì)胞甚至B淋巴細(xì)胞在抗腫瘤過程中所扮演的角色［11，12］，探究紫蘇寧、矢車菊素 3，5-二葡萄糖苷對上述細(xì)胞的作用同樣具有實(shí)用意義。

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