楊樂 鄒曉靜

【摘要】目的 探討心肌細胞缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導心肌細胞線粒體功能損傷的影響。方法 培養(yǎng)新生乳鼠心肌細胞，隨機（隨機數(shù)字法）分為4組。① C組：常規(guī)心肌細胞培養(yǎng)，不予任何處理；②LPS組：給予1μg/ml LPS，培養(yǎng)2 h；③YC-1＋LPS組：預給HIF-1α特異性抑制劑YC-1 4 μmol/L培養(yǎng)8 h，再加入1μg/ml LPS，培養(yǎng)2 h；④YC-1組：僅給予4 μmol/L YC-1培養(yǎng)8h。利用熒光分光光度計測定線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, MMP） ，熒光素酶法測定細胞ATP含量，比色法測定細胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase, COX）活性，Western blot測定細胞色素氧化酶亞單位1,2的蛋白表達水平。結果 與C組相比，LPS顯著抑制心肌細胞MMP、COX活性，ATP含量也顯著降低（P＜0.05），并抑制COX-1蛋白表達（P＜0.05），上調(diào)COX-2蛋白表達（P＜0.05）。與LPS組相比，HIF-1α抑制劑YC-1能進一步降低心肌細胞MMP、COX活性及ATP含量（P＜0.01），顯著增加COX-1表達并使COX-2表達的下調(diào)（P＜0.01）。結論 HIF-1α抑制劑YC-1可能通過改變COX-1及COX-2表達，加重LPS所致的心肌細胞線粒體功能的損傷，提示HIF-1α對LPS誘導的心肌細胞線粒體損傷可能具有保護作用。

【關鍵詞】脂多糖；缺氧誘導因子-1α；心肌細胞；線粒體

Effects of HIF-1α on mitochondrial function of cardiomyocytes stimulated by lipopolysaccharideYANG Le, ZOU Xiao-jing* . *Department of Anesthesiology, Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

Corresponding author: ZOU Xiao-jing, Email: xjzou68@yahoo.com

【Abstract】Objective To investigate the effects of HIF-1α, on mitochondrial function of cardiomyocytes stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods Cultured neonatal cardiomyocytes were randomly (random number) distributed to four groups (n=5). Control group: the neonatal cardiomyocytes were cultured in normal condition without any treatmeat; LPS group: cardiomyocytes were exposed to 1μg/ml LPS for 2 h; YC-1+LPS group: cardiomyocytes were exposed to 4 μmol/L YC-1 for 8 h before LPS treatment; YC-1 group: cardiomyocytes were exposed to 4μmol/L YC-1 for 8 h. As indexes of mitochondrial function, MMP, the content of ATP and the activity of cytochrome oxidase were measured, COX1/2 protein expression was determined by Western blotting. Results Compared with control group, LPS decreased MMP, the content of ATP and the activity of COX obviously(P<0.05), depressed the expression of COX-1 protein (P<0.05), induced the expression of COX-2 protein (P<0.05). Compared with the LPS group, MMP, the content of ATP and the activity of COX were markedly attenuated (P<0.01), the expression of COX-1 was significantly increased and the expression of COX-2 was decreased in theYC-1＋LPS group (P<0.01).Conclusions YC-1 attributes to the dysfunction of mitochondrial of myocyte by alterating the expression of COX-1 and 2, HIF-1α may attenuate the mitochondrial dysfunction of cadiomyocytes stimulated by LPS.

【Key words】Lipopolysaccharide; Hypoxia inducible factor-1α; Cardiomyocyte; Mitochondrial

膿毒癥是感染所致的全身炎癥反應綜合征，是多器官功能障礙的重要原因^［1］。膿毒癥患者通常伴有心功能障礙，包括收縮性和舒張性功能障礙，有研究表明膿毒癥大鼠心肌出現(xiàn)力學和酶學雙重改變^［2-3］。目前研究認為膿毒癥心肌抑制可能與線粒體呼吸功能障礙及氧化磷酸化功能受損有關^［4］。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)可誘導原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)表達明顯上調(diào)，但HIF-1α與膿毒癥心肌抑制的關系尚未可知。HIF-1α可調(diào)控與線粒體分子氧利用有關的多個代謝途徑，本實驗擬建立膿毒癥心肌抑制的細胞模型，利用HIF-1α抑制劑YC-1研究HIF-1α對膿毒癥心肌細胞線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

LPS購自sigma公司，3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh (YC-1) 購自美國Alexis公司，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）及ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，細胞色素C氧化酶檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，羊抗COX-1多克隆抗體及羊抗COX-2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 心肌細胞培養(yǎng)

健康新生1～2 d Wistar大鼠，清潔級，雌雄不拘，5～10 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，碘伏消毒，取出心臟于4 ℃無菌D-Hanks液洗凈殘血，剔除心房及心底大血管，將心室肌剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，用0.1％胰酶于37 ℃水浴振蕩分次消化5～8次，每次8 min。收集除第1次外的細胞懸液，1 000 r/min 離心8 min，棄上清，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞至培養(yǎng)瓶。37 ℃，5％ CO₂培養(yǎng)箱中，靜置90 min差速貼壁后，取上清，加入終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿苷，培養(yǎng)48 h后換無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進行實驗。

1.3 實驗分組及藥物干預

實驗隨機分為4組。① 健康對照組：常規(guī)心肌細胞培養(yǎng)，不予任何處理；②LPS組：給予1 μg/ml LPS，培養(yǎng)2 h；③LPS＋YC-1組：預給HIF-1α特異性抑制劑YC-1 4 μmol/L培養(yǎng)8 h組^［5-6］，再加入1 μg/ml LPS，培養(yǎng)2 h；④YC-1組：僅給予4 μmol/L YC-1培養(yǎng)8 h組。

1.4 線粒體制備

采用蔗糖梯度離心法^［7］提取線粒體。0.25%胰酶消化原代培養(yǎng)心肌細胞，1 000 r/min離心收集細胞。用緩沖液A(134 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 0.7 mmol/L Na2HPO4, 10 mmol/L Tris，pH 7.5)清洗后，重懸于1.5 ml緩沖液B(10 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris，pH 7.5)，冰上放置5 min后轉入玻璃勻漿器勻漿，然后立即加入0.3 ml 緩沖液C(2 mol/L 蔗糖，35 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris，pH 7.5 )混勻，3000 r/min 離心4 min，取上清于14 000 r/min 離心20 min，所得沉淀為線粒體組分。緩沖液D (0.21 mol/L 甘露醇，70 mmol/L 蔗糖，5 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，pH 7.5)清洗2次得到線粒體。上述所有緩沖液均在冰浴條件下使用。蛋白定量：應用考馬斯亮蘭法，采用美國PE公司生產(chǎn)的多孔板(熒光、紫外線、可見光)高效分析儀(型號：HTS 7000 Plus)，加入線粒體提取液，在波長595 nm測定吸光度后計算蛋白質含量。以上操作均在0～2 ℃進行，分離介質始終保持有冰渣狀態(tài)。

1.5 線粒體膜電位檢測

采用JC-1熒光探針檢測。JC-1是一種能滲透到細胞器內(nèi)并特異性與細胞中線粒體結合的熒光染劑。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體產(chǎn)生綠色熒光。0.25%胰酶消化細胞，1000 r/min離心收集細胞。加入無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液漂洗2遍，加入1 ml PBS緩沖液，再將1 g/L JC-1加入，使之終濃度為1.5 mg/L，37 ℃負載15 min，1000 r/min離心5 min后去除JC-1，PBS洗3遍后用熒光分光光度計檢測。檢測JC-1單體時即綠色熒光時可以把激發(fā)光設置為490 nm，發(fā)射光設置為530 nm；檢測JC-1聚合物即紅色熒光時，可以把激發(fā)光設置為525 nm，發(fā)射光設置為590 nm。計算紅綠熒光比值，比值與MMP成正比。

1.6 熒光素酶ADP/ATP發(fā)光檢測

取1×106細胞，加入1 ml裂解液后勻漿。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，保留上清。冰浴上溶解待用試劑，ATP標準溶液稀釋成0.001 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L 5個濃度。按照1∶100的比例用ATP檢測試劑稀釋液稀釋ATP檢測試劑。在檢測孔或檢測管內(nèi)加上10 μl樣品或標準品，迅速混勻，間隔6 s后立即用液閃儀測定相對發(fā)光強度值。根據(jù)標準曲線計算出樣品中ATP的濃度。各組蛋白定量，把ATP的濃度換算成nmol/mg蛋白的形式。

1.7 細胞色素C氧化酶活性測定

基于還原型細胞色素C轉化為氧化型細胞色素C的變化來測定COX的活性。參照說明書采用比色法測定酶活性(μmol/mg)。酶活性單位定義為25 ℃，pH 7.0時，每單位酶在單位時間內(nèi)氧化1 μmol細胞色素C所需要的酶量，即為1個酶活性單位。

1.8 COX亞單位1，2（COX-1，2）蛋白表達測定

用TRI reagent提取各組細胞蛋白質。取蛋白質20 μg以10％SDS-PAGE電泳分離；半干電轉移蛋白到PVDF膜，5％牛血清白蛋白封閉，加一抗羊抗COX-1(1∶ 500)，羊抗COX-2（1∶ 500）及兔抗α-actin(1∶ 500)4℃孵育過夜。洗滌后加入二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h。洗滌后，顯色劑ECL曝光，顯影，定影。以 -actin為內(nèi)參照。對結果進行吸光度掃描分析，以ACOX-1/A -actin及ACOX-2/A-actin表示蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，多組間資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞MMP、COX活性及ATP的變化

與對照組相比，LPS顯著抑制心肌細胞MMP、COX活性及ATP含量（P＜0.05），YC-1可顯著增強LPS對心肌細胞的這種效應，即與LPS組相比近一步抑制MMP、COX活性及ATP含量（P＜0.01）。見表1。

2.2 YC-1對線粒體COX亞單位表達的影響

如圖1、表2所示，與健康對照組相比，LPS顯著抑制COX-1蛋白表達（P＜0.05），上調(diào)COX-2蛋白表達（P＜0.05）。與LPS組相比，預先給予YC-1可顯著升高COX-1蛋白表達，降低COX-2蛋白表達（P＜0.01）。

3 討論

本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)LPS誘導原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞HIF-1α蛋白表達顯著上調(diào)。作為一種對氧氣敏感的轉錄因子超家族，HIF-1α主要負責眾多的低氧誘導基因的表達調(diào)控，與一系列的細胞效應如線粒體活性氧的產(chǎn)生，能量代謝，血管發(fā)生等密切相關。目前認為HIF-1α對細胞缺血缺氧性損傷具有保護效應^［8-9］。LPS導致心肌損傷，心功能障礙與LPS誘導心肌細胞氧化應激密切相關^［10］，HIF-1α作為氧調(diào)控信息通路中的重要因子，對LPS誘導的心肌細胞損傷是否也具有心肌保護作用？YC-1是一種新型HIF-1α抑制劑，通過使HIF-1α的C末端激活區(qū)失活而對其發(fā)揮翻譯后水平的抑制^［11］。本實驗通過觀察HIF-1α抑制劑YC-1對線粒體功能的影響來探討HIF-1α在LPS誘導的心肌細胞損傷中的可能作用。

線粒體功能障礙是膿毒癥心肌抑制的關鍵環(huán)節(jié)^［12］，主要表現(xiàn)為線粒體呼吸功能障礙，細胞無法有效利用氧分子而導致細胞性低氧狀態(tài)，并且ATP合成下降無法滿足心肌能量代謝需求^［4］。MMP、ATP含量及COX活性是評價線粒體功能的重要指標。由于線粒體內(nèi)膜兩側質子及其他離子不對稱分布而形成MMP，其對維持線粒體內(nèi)膜對各種物質的選擇性與通透性及線粒體正常的形態(tài)結構與功能都具有重要作用，線粒體膜電位下降將導致線粒體功能嚴重受損。本研究中，LPS使心肌細胞MMP顯著下降，同時伴有COX活性降低及ATP含量下降，在LPS作用的新生乳鼠心肌細胞上再次驗證了膿毒癥心肌細胞線粒體功能受損。COX存在于線粒體內(nèi)膜，是線粒體氧化呼吸產(chǎn)能和呼吸鏈電子傳遞的限速酶。COX作為線粒體呼吸鏈的終端酶，構成電子傳遞鏈的重要環(huán)節(jié)，催化其底物亞鐵細胞色素C傳遞電子給氧分子形成水，并與氧化磷酸化偶聯(lián)產(chǎn)生ATP為細胞功能活動提供能量，故被視為線粒體呼吸鏈的標志酶，其活性的喪失意味著呼吸電子鏈的中斷及氧分子利用障礙，導致三磷酸腺苷(ATP)生成不足^［13］。在本實驗結果中，LPS抑制COX活性，減少ATP含量，提示LPS可至心肌細胞線粒體氧化磷酸化功能受損，導致心肌細胞能量代謝障礙。而與LPS組相比，YC-1則進一步降低MMP，抑制COX的活性，減少ATP的合成，提示HIF-1α與COX酶活性關系密切。在LPS誘導的膿毒癥心肌損傷中，誘導HIF-1α表達可能通過調(diào)節(jié)COX酶活性發(fā)揮細胞保護作用。

LPS可顯著抑制COX-1蛋白表達同時誘導COX-2蛋白表達上調(diào)，而HIF-1α抑制劑YC-1則顯著抑制了LPS作用下心肌細胞COX亞單位表達的變化。COX有13個亞單位，3個催化亞單位，10個結構亞單位。結構亞單位由核DNA編碼，催化亞單位COX-1，COX-2和COX-3由線粒體DNA編碼，在真核細胞中遺傳高度保守。在哺乳動物細胞COX-1呈優(yōu)勢表達，在某些組織可選擇性表達COX-2。COX-1與COX-2一起構成COX的活性中心^［14］，是調(diào)控線粒體氧化調(diào)節(jié)能力的關鍵所在。利用盲腸結扎穿孔的膿毒癥動物模型研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥心肌組織COX活性喪失，其亞單位COX-1的mRNA及蛋白水平顯著下降，給予外源性細胞色素C可改善膿毒癥小鼠的心室功能^［15］，結果與本實驗一致。LPS可能通過影響COX活性中心的COX1/2蛋白表達而抑制COX活性。研究證明，低氧條件下HIF-1α活化，它與定位于COX-2基因第一個內(nèi)含子的5區(qū)的低氧反應元件結合，誘導COX-2 mRNA表達上調(diào)，并上調(diào)線粒體蛋白酶LON以加速COX-1蛋白的降解，通過改變COX-1/2蛋白表達比例以增加電子傳遞速度，加快COX更新，優(yōu)化線粒體呼吸鏈功能，增加ATP合成^［16］。本研究結果提示，在LPS誘導的心肌細胞損傷中，HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)COX-1/2的表達比例，提高COX活性，從而改善線粒體功能。

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（收稿日期：2012-02-07）

（本文編輯：何小軍）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.009

基金項目：國家自然科學基金(30901405、81102691)

作者單位：430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院急診內(nèi)科（楊樂）；華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科（鄒曉靜）

通信作者：鄒曉靜，Email:xjzou68@yahoo.com

中華急診醫(yī)學雜志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P836-839