葛慧青 徐培峰 陸志華 朱濤 袁月華 應(yīng)可凈

腹內(nèi)高壓（intra-abdominal hypertension，IAH）是多種內(nèi)外科危重疾病的高危并發(fā)癥,其發(fā)病隱匿、病死率高,近十年來(lái)逐漸引起國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的高度重視。腹內(nèi)高壓時(shí)不僅引起腹腔內(nèi)臟器灌注不足與臟器功能損害，還影響腹腔外器官特別是呼吸功能的損害，并導(dǎo)致呼吸衰竭^［1-6］。呼吸衰竭患者的主要支持手段是人工機(jī)械通氣，為呼吸衰竭的各種病因治療爭(zhēng)取時(shí)間和創(chuàng)造條件。但機(jī)械通氣時(shí)膈肌的去負(fù)載失活可誘導(dǎo)發(fā)生膈肌功能不全（ventilation-induced diaphragmatic dysfunction, VIDD）。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)IAH對(duì)呼吸系統(tǒng)影響的研究都集中在呼吸力學(xué)、氧合功能等方面。而作為機(jī)體最主要的呼吸肌，膈肌的功能狀態(tài)對(duì)整個(gè)呼吸功能起著重要的作用。腹內(nèi)高壓同時(shí)伴呼吸衰竭需機(jī)械通氣時(shí)，其腹內(nèi)壓增高是否對(duì)膈肌功能產(chǎn)生進(jìn)一步影響，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康新西蘭大白兔15只(普通級(jí))，體質(zhì)量2.1～2.3 kg，雌雄不限，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有的操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，但可進(jìn)水。8%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)通雙側(cè)耳緣靜脈，進(jìn)行氣管切開(kāi)插管（直徑3.5 mm）、左頸總動(dòng)脈置管血壓監(jiān)測(cè)。微泵咪唑安定1 mg/(kg?h)靜脈注射維持鎮(zhèn)靜。各組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)經(jīng)兔耳正中動(dòng)脈監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，維持生命體征穩(wěn)定。根據(jù)血?dú)庹{(diào)整吸入氣氧飽和度（FIO₂）、潮氣量（VT）和呼吸頻率（RR），或者靜脈滴注5%碳酸氫鈉注射液糾正酸中毒。

1.2 動(dòng)物分組

將15只新西蘭白兔隨機(jī)分3組（隨機(jī)數(shù)字表法），每組5只。(1)CMV組：容量控制機(jī)械通氣(RODENT VENTILATOR DH-150，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院儀器設(shè)備廠)，呼吸頻率RR40～50次/min、VT 6～8 ml/kg、吸呼比（I/E）1∶ 2～1∶ 3、FIO₂ 1 L/min。根據(jù)血?dú)庹{(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，維持PaCO₂在35～45 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，PaO₂>70 mm Hg。^［7］（2）CMV+IAH組：機(jī)械通氣和鎮(zhèn)靜等支持方法同CMV組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔內(nèi)沖入氮?dú)?，使腹腔?nèi)壓力保持在12 mm Hg水平。（3）對(duì)照組：不進(jìn)行機(jī)械通氣，耳緣靜脈注入10～20 ml空氣處死動(dòng)物。

1.3 膈肌標(biāo)本采集

CMV組和CMV+IAH組通氣6 h后，耳緣靜脈注入10～20 ml空氣處死動(dòng)物，剖腹取左半膈肌組織，分別用于免疫組化和Western blotting，對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；透射電鏡下觀察膈肌肌纖維的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 Caspase-3指標(biāo)測(cè)定

膈肌標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、制成蠟塊，石蠟切片行免疫組化步驟（SABC法）進(jìn)行顯微鏡下觀察組織染色情況并拍照。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定: 光學(xué)顯微鏡下，采用雙盲法觀片。觀察在良好的組織結(jié)構(gòu)及清晰的背景上細(xì)胞膜和肌細(xì)胞核上出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，以表達(dá)為陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量占這些切片中該類細(xì)胞總數(shù)的比率作為這個(gè)組織的陽(yáng)性率。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。按每高倍鏡視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比記分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10％為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10％～50％為1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51％～75％為2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75％為3分。按著色強(qiáng)度記分：不著色者記為0分；染色弱、呈淡黃色者記為1分；染色中等、呈黃色者記為2分；染色強(qiáng)、呈棕黃色者記為3分。兩種記分的乘積決定蛋白表達(dá)的高低：＜4分者認(rèn)為低表達(dá)，≥6分者認(rèn)為高表達(dá)。

膈肌組織經(jīng)RIPA蛋白裂解液裂解組織，提取總蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)Caspase-3的蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)GAPDH內(nèi)參來(lái)校正上樣量或表達(dá)誤差，并測(cè)定灰度值進(jìn)行比較。

1.5 組織學(xué)觀察

膈肌組織輕微牽拉至原位長(zhǎng)度置入2.5％戊二醛固定液中固定，0.1 mol/L pH 7.01磷酸緩沖液漂洗，用1％鋨酸后固定1～2 h時(shí)后，鉀砷酸鹽緩沖液漂洗，再次0.1 mol/L pH 7.01 磷酸緩沖液漂洗,梯度酒精脫水，包埋劑和丙酮混合液(V/V=1/1)處理,存包埋劑處理樣品70℃加熱過(guò)夜，超薄切片(70 nm)，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，日本JEOL公司的JEM-1230型透射電鏡中觀察。電鏡下觀察肌絲的排列，線粒體形態(tài)、大小和分布，以及細(xì)胞核等超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s ）表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)比較采用單因素方差分析，所有資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膈肌細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)

Caspase-3蛋白主要表達(dá)在膈肌細(xì)胞核上，其次在細(xì)胞膜上。CMV組的肌細(xì)胞核上呈棕黃或者棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為25%～60%，Caspase-3蛋白呈中等表達(dá)(4.20±0.39)分; CMV+IAH組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為55%～85%， Caspase-3蛋白呈高表達(dá)（7.12±0.54）分，見(jiàn)圖1。

A（×200）和B（×400）為Caspase-3在對(duì)照組中的表達(dá)；C（×200）和D（×400）為Caspase-3在CMV 6 h組中的表達(dá)；E（×200）和F（×400）為Caspase-3在CMV+IAH6h組中的表達(dá) 。 與對(duì)照組比較,aP＜0.01；CMV+IAH與CMV組比較,bP＜0.01

Weatern blot結(jié)果顯示，內(nèi)參為均一顯影的條帶，Caspase 3顯影條帶密度不同(圖2)，以Caspase 3灰度值/GAPDH灰度值表示Capase 3蛋白相對(duì)表達(dá)水平，將相應(yīng)對(duì)照組Caspase 3蛋白表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1，計(jì)算Ratio（圖1），CMV組、CMV+IAH組Caspase 3蛋白的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），CMV+IAH組與CMV組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示CMV+IAH促進(jìn)膈肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。以上結(jié)果均重復(fù)3次。

2.2 IAH對(duì)機(jī)械通氣兔膈肌組織病理的影響

電鏡下可見(jiàn)，CMV組肌絲整齊但排列疏松，局部肌絲模糊、肌絲紊亂，Z線清晰，脂質(zhì)空泡形成。部分線粒體腫脹明顯,嵴膜斷裂,空泡形成；CMV+IAH組膈肌結(jié)構(gòu)損傷最明顯,出現(xiàn)肌絲結(jié)構(gòu)紊亂，排列不整齊，Z線模糊。肌原纖維間線粒體溶解、腫脹、基質(zhì)空亮、嵴變形，局部線粒體空泡化，膜結(jié)構(gòu)消失;而對(duì)照組肌原纖維排列整齊，肌絲、肌節(jié)清晰，無(wú)腫脹，Z線排列整齊；線粒體形狀規(guī)則，外膜完整，嵴致密、豐富。見(jiàn)圖3。

A：對(duì)照組；B：CMV組、C：CMV+IAH組 ;紅色箭頭處為線粒體，黃色箭頭處為Z線，綠色箭頭處為斷裂的肌纖維

3 討論

腹內(nèi)高壓（intra-abdominal hypertension，IAH）是指由于腹內(nèi)壓力持續(xù)性升高大于等于12 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）時(shí)引起的一系列心、肺、肝、腎、神經(jīng)等全身各系統(tǒng)功能障礙。流行病學(xué)顯示，內(nèi)科及外科重癥患者中IAH的發(fā)病率分別為54.4%和65.0%，且IAH是重癥患者的獨(dú)立死亡危險(xiǎn)因素，伴有IAH的重癥患者較不伴有IAH的重癥患者病死率增加26% (53% vs. 27%)^［8］。有研究表明，腹腔內(nèi)壓力與氣道平臺(tái)壓直線相關(guān)^［9］，IAH可降低呼吸系統(tǒng)靜態(tài)順應(yīng)性，增加氣道阻力，增加肺泡-動(dòng)脈氧分壓差及呼吸死腔，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致呼吸功能衰竭^［10-11］。Papavramidis等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示慢性IAH膈肌肌纖維發(fā)生重塑，ⅡA型肌纖維減少，ⅡB型肌纖維增加，提高了膈肌對(duì)應(yīng)負(fù)荷增加的能力，但同時(shí)慢性IAH增加實(shí)驗(yàn)兔膈肌氧化應(yīng)激反應(yīng)^［12］。

多項(xiàng)研究顯示，機(jī)械通氣時(shí)膈肌的去負(fù)載失活是誘導(dǎo)膈肌功能失調(diào)的重要原因，可能是臨床撤機(jī)失敗的重要原因之一。臨床上將之定義為機(jī)械通氣誘導(dǎo)的膈肌功能不全（VIDD）。IAH對(duì)VIDD的影響目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械通氣6 h后，CMV組Casepase-3蛋白活性表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），提示在控制通氣的早期即可引起膈肌氧化應(yīng)激的改變，而CMV+IAH組在一定程度上加劇了氧化應(yīng)激的發(fā)生（與對(duì)照組比較,P＜0.01,與CMV組比較,P＜0.05）。氧化應(yīng)激是VIDD的早期表現(xiàn)，在VIDD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起主要作用。氧化應(yīng)激不僅可造成膈肌結(jié)構(gòu)的直接損傷，還可加速膈肌蛋白分解，導(dǎo)致膈肌萎縮。Zergeroglu等^［13］研究發(fā)現(xiàn)，控制通氣3～6 h，膈肌即可發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致膈肌蛋白和脂質(zhì)過(guò)氧化，且氧化損傷程度隨時(shí)間進(jìn)行性加重，而活性氧族介導(dǎo)的線粒體過(guò)氧化損傷可能是導(dǎo)致VIDD的重要原因之一。細(xì)胞凋亡的研究中，Casepase-3在凋亡發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用^［14］。而CMV+IAH組中膈肌細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)與CMV組比較明顯增強(qiáng),提示IAH加重控制通氣所導(dǎo)致的膈肌氧化應(yīng)激。

研究發(fā)現(xiàn)，控制通氣可導(dǎo)致肌原纖維斷裂，線粒體腫脹，脂質(zhì)空泡增加^［7，15］。在本研究中，CMV+IAH組出現(xiàn)明顯的膈肌超微結(jié)構(gòu)損傷，且較CMV組更劇，考慮可能與以下因素有關(guān)。(1)膈肌缺血缺氧：CMV組膈肌被動(dòng)收縮膈肌血流量的下降，而IAH增加了膈肌局部的壓力，進(jìn)一步加重了膈肌的缺血缺氧；（2）間接損傷：由于腹內(nèi)高壓引起腹腔內(nèi)各臟器血流減少，導(dǎo)致機(jī)體全身炎癥反應(yīng)；（3）機(jī)械因素。

正常機(jī)體處于氧化和抗氧化的平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，超過(guò)其清除的能力時(shí)就會(huì)發(fā)生過(guò)氧化損傷。機(jī)械通氣時(shí)膈肌的氧化應(yīng)激將迅速發(fā)生。這與膈肌去負(fù)載失活的同時(shí)肺的反復(fù)膨脹而發(fā)生被動(dòng)收縮有關(guān)，導(dǎo)致產(chǎn)生自由基的速度及種類均不同于單純制動(dòng)的肌肉 。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， CMV組6 h后出現(xiàn)局部肌絲模糊、肌絲紊亂，脂質(zhì)空泡形成。部分線粒體腫脹明顯,嵴膜斷裂,空泡形成，提示在實(shí)驗(yàn)兔6 h膈肌去負(fù)載即出現(xiàn)了膈肌超微結(jié)構(gòu)的改變；而CMV+IAH機(jī)械通氣組6 h后，膈肌肌節(jié)間大量線粒體內(nèi)膜變形，部分溶解。線粒體內(nèi)膜受損會(huì)破壞其選擇通透性，從而破壞內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子電化學(xué)梯度并導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，從而產(chǎn)生大量的氧自由基 ，損傷膈肌。同時(shí)線粒體內(nèi)膜的損壞影響了ATP能量的生成，加速了細(xì)胞的死亡。缺血及缺血再灌注是造成細(xì)胞凋亡的另一原因。它們主要造成能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載及自由基相關(guān)的損傷 。在本實(shí)驗(yàn)中，盡管動(dòng)脈血氧分壓及血壓都保持正常，但是由于實(shí)驗(yàn)條件有限,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)法監(jiān)測(cè)到局部的血流及血氧飽和度。Brancatisano等^［15］研究表明被動(dòng)機(jī)械通氣能明顯降低動(dòng)物膈肌血流量。這種由機(jī)械通氣造成的膈肌局部缺血可能是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的原因之一，較高的腹內(nèi)壓有可能加劇局部缺血而加速細(xì)胞的凋亡。

參考文獻(xiàn)

［1］Manu GM，Michael LC，Andrew K，et al. Results from the International Conference of Experts on Intra-abdominal Hypertension and Abdominal Compartment Syndrome ［J］. Intensive Care Med，2006， 32(11)：1722-1732.

［2］ Joynt GM, Wai JK. Intra-abdominal hypertension and abdominal compartment syndrome - making progress ［J］. Anaesth Intensive Care， 2012，40(1)：11-13.

［3］ Chalkias A, Xanthos T. Intra-abdominal hypertension: a potent silent killer of cardiac arrest survivors ［J］. Am J Emerg Med，2012，30(3)：502-504.

［4］ Mahjoub Y, Lorne E, Maizel J, et al. Effect of intra-abdominal hypertension on left ventricular relaxation: a preliminary animal study ［J］. Br J Anaesth，2012， 108(2)：211-215.

［5］ Mohmand H, Goldfarb S. Renal dysfunction associated with intra-abdominal hypertension and the abdominal compartment syndrome ［J］. J Am Soc Nephrol， 2011，22(4)：615-621.

［6］ 馬靜,陳華文,吳雷,等.產(chǎn)后大出血腹內(nèi)高壓與急性腎功能衰竭的關(guān)系［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2009，18（12）：1330-1331.

［7］ Sassoon CSH，Caiozzo VJ，Manka A，et al. Altered diaphragm contractile properties with controlled mechanical ventilation ［J］. J Appl Physiol，2002，92(6)：2585-2595.

［8］ Malbrain ML，Chiumello D，Pelosi P，et al. Prevalence of intra-abdominal hypertension in critically ill patients: a multicentre epidemio-logical study ［J］. Intensive Care Med，2004, 30(5)：822-829.

［9］ Vidal MG, Ruiz Weisser J, Gonzalez F, et al. Incidence and clinical effects of intra-abdominal hypertension in critically ill patients ［J］. Crit Care Med，2008，36(6)：1823-1831.

［10］ Brian DK，Louis AG，Edgar JJ，et al. Plateau and transpulmonary pressure with elevated intra-abdominal pressure or atelectasis［J］. J Surl Res，2010，159(1)：e17-e24.

［11］ Da Silva Almeida JR，Machado FS，Schettino GP，et al. Cardiopulmonary effects of matching positive end-expiratory pressure to abdominal pressure in concomitant abdominal hypertension and acute lung injury ［J］. J Trauma，2010 ，69(2)：375-383.

［12］ Papavramidis TS, Kotidis E, Ioannidis K, et al. The effects of chronically increased intra-abdominal pressure on the rabbit diaphragm ［J］. Obes Surg，2012，22(3)：487-492.

［13］ Zergeroglu MA，McKenzie MJ，Shanely RA，et al. Mechanical ventilation-induced oxidative stress in the diaphragm ［J］. J Appl Physiol ，2003，95(3)：1116-1124.

［14］ Joseph M, McClung, Andreas N, et al. Caspase-3 regulation of diaphragm myonuclear domain during mechanical ventilation-induced atrophy ［J］. Am J Respir Crit Care Med，2007， 175(2)：150-159.

［15］ Brancatisano A， Amis TC，Tully A，et al. Regional distribution of blood flow within the diaphragm ［J］. J Appl Physiol，1991,71(2):583-589.

（收稿日期：2012-01-17）

（本文編輯：沈惠云）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.012

基金項(xiàng)目: 浙江省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（Y201017208）

作者單位：310016 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 浙江大學(xué)邵逸夫醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所

通信作者:應(yīng)可凈，Email:Yingsrrsh@163.com

中華急診醫(yī)學(xué)雜志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P851-854