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      通脈膠囊微生物限度檢查方法的驗證

      2012-10-20 11:59:20天津醫(yī)科大學總醫(yī)院300052李彬
      首都食品與醫(yī)藥 2012年14期
      關鍵詞:平皿試液埃希菌

      天津醫(yī)科大學總醫(yī)院(300052)李彬

      通脈膠囊是由丹參、赤芍、草決明、郁金、莪術、王不留行等8味中藥組成的中藥制劑,具有活血行氣,安神寧心的功效。根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定,藥品在進行微生物限度檢查前必須對其檢查方法進行驗證,以確認該供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后在進行檢查,才能真實反映該藥品受污染的程度[1]。

      1 儀器與試藥

      1.1 儀器 LIBRORAEG120電子天平(川本島津);YJA電動勻漿儀(臺州市椒江五星機械儀器有限公司);MJX-1501培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。

      1.2 試藥與培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號080919),玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號080606),膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號080528),營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號070111),pH7.0的無菌氫氧化鈉-蛋白胨緩沖液(批號070413),改良馬丁培養(yǎng)基(批號080408),均為中國藥品生物制品檢定所提供;通脈膠囊(批號20110605)。

      1.3 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003],均由中國藥品生物制品檢定所提供。

      2 方法與結果

      2.1 菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,于30℃~35℃培養(yǎng)18~24小時;取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)18小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)約為50~100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5~7天后加入4mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫后,用管口帶有薄的無菌棉花吸出孢子懸液至無菌試管內,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)約為50~100cfu的孢子懸液。

      2.2 供試液的制備 取本品10g,加pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL,用勻漿儀,混勻,作為1:10的供試液。

      2.3 方法驗證

      2.3.1 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

      2.3.1.1 細菌計數(shù)的驗證

      2.3.1.1.1 試驗組 ①常規(guī)法:取2.2項下制備的供試液1mL和1mL試驗菌(約50~100cfu)分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝。每株試驗菌平行制備2個平皿。在30℃~35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時,點計菌落數(shù),取均值。②培養(yǎng)基稀釋法:取2.2項下制備的供試液2mL,每1mL等量分注5個平皿,即每皿0.2mL,每皿中加入1mL試驗菌(約50~100cfu),立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝。培養(yǎng)時間與常規(guī)法相同。

      2.3.1.1.2 菌液組 取1mL試驗菌(約50~100cfu),分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,按平皿法測定所加的試驗菌數(shù)(分別為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)。

      2.3.1.1.3 供試品 對照組按試驗組的方法,不加菌懸液,按菌落計數(shù)方法測定供試品菌數(shù)(本底菌)。

      2.3.1.1.4 稀釋劑 對照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個平皿中,培養(yǎng)基注皿,培養(yǎng),計數(shù)。

      2.3.1.2 霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

      2.3.1.2.1 試驗組 ①常規(guī)法:取2.2項下制備的供試液1mL和1mL試驗菌(約50~100cfu)分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝。每株試驗菌平行制備2個平皿。在23℃~28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時,點計菌落數(shù),取均值。②培養(yǎng)基稀釋法:取2.2項下制備的供試液2mL,每1mL等量分注5個平皿,即每皿0.2mL,每皿中加入1mL試驗菌(約50~100cfu),立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝。培養(yǎng)時間與常規(guī)法相同。

      2.3.1.2.2 菌液組 取1mL試驗菌(約50~100cfu),分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,按平皿法測定所加的試驗菌數(shù)(分別為白色念珠菌和黑曲霉菌)。2.3.1.2.3 供試品 對照組按試驗組的方法,不加菌懸液,按菌落計數(shù)方法測定供試品菌數(shù)(本底菌)。

      2.3.1.2.4 稀釋劑 對照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個平皿中,培養(yǎng)基注皿,培養(yǎng),計數(shù)。試驗組菌回收率=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/試驗組菌落數(shù)×100%;稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組菌落數(shù)/試驗組菌落數(shù)×100%?!吨袊幍洹芬?guī)定對各試驗菌株的回收率均不得低于70%。用常規(guī)法測定該品種對5個試驗菌株的回收率,以確定其抑菌程度(見附表1)。

      由附表1可知,本品對大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無抑菌作用,而對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。采用培養(yǎng)劑稀釋法測定各試驗菌株的回收率(見附表2)。

      由附表2可知,采用培養(yǎng)劑稀釋法可有效消除藥品對各試驗菌株的抑菌作用。

      2.3.2 控制菌檢查法的驗證 (見附表3)

      2.3.2.1 大腸埃希菌檢查法的驗證

      2.3.2.1.1 試驗組 取10mL 2.2項下制備的供試液和1mL大腸埃希菌(約50~100cfu)加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。

      2.3.2.1.2 陰性菌對照組 取10mL 2.2項下制備的供試液和1mL金黃色葡萄球菌(約50~100cfu)加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。

      2.3.2.1.3 陽性對照組 取1mL 大腸埃希菌(約50~100mL)加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。取試驗組、陰性菌對照組和陽性對照組上述培養(yǎng)物各0.2mL,分別接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內培養(yǎng),于5、24小時在366nm紫外光下觀察,試驗組管MUG陽性,靛基質陽性;陰性菌對照組MUG陰性,靛基質陰性;陽性對照組管MUG陽性,靛基質陽性。

      2.3.2.1.4 試驗結果 陽性對照組檢出大腸埃希菌;陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌;試驗組檢出大腸埃希菌。驗證結果符合要求。

      附表1 常規(guī)法測定各試驗菌株的回收率(%)

      附表2 培養(yǎng)劑稀釋法測定各試驗菌株的回收率(%)

      附表3 控制菌驗證結果

      2.3.2.2 大腸菌群檢查法的驗證

      2.3.2.2.1 試驗組 取1mL 2.2項下制備的供試液和1mL大腸埃希菌(約50~100cfu)加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。

      2.3.2.2.2 陰性菌對照組 取1mL 2.2項下制備的供試液和1mL金黃色葡萄球菌(約50~100cfu)加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。

      2.3.2.2.3 陽性對照菌 取1mL 2.2項下制備的供試液和1 m L大腸埃希菌(約50~100cfu)加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。試驗組管和陽性對照組管均有菌生長且產(chǎn)酸產(chǎn)氣,陰性菌對照組無菌生長且不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。結果:試驗組檢出大腸菌群;陰性菌未檢出大腸菌群;陽性對照組檢出大腸菌群。

      2.3.2.3 供試品控制菌檢查 取10mL 2.2項下制備的供試液置100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,依法檢查,結果顯示,樣品每1g中未檢出大腸埃希菌。

      2.4 結果 試驗結果顯示,細菌計數(shù)采用培養(yǎng)劑稀釋法;霉菌和酵母菌計數(shù)采用平皿法;控制菌采用常規(guī)法。

      3 討論

      中藥制劑的微生物限度檢查通常是按常規(guī)的藥品衛(wèi)生學檢驗方法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的。由于中成藥是含有多種成分的復方制劑,其中任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準確性[2]。因此,本試驗以5種陽性對照菌的回收率作為評價指標,確定了通脈膠囊的微生物限度檢查方法。該方法可用于通脈膠囊微生物的質量控制。

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