Zacopride增強(qiáng)心肌內(nèi)向整流鉀電流(IK1)效應(yīng)的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路*

劉清華, 許言午， 吳博威

(山西醫(yī)科大學(xué)1病理生理教研室, 2生理教研室,3細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太原030001；4上海中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，上海 201200)

1000-4718(2012)01-0006-05

2011-05-23

2011-11-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30840038);山西省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 2009021043-2)

△通訊作者 Tel: 0351-4135067; E-mail: liuqh20041206@163.com

Zacopride增強(qiáng)心肌內(nèi)向整流鉀電流(IK1)效應(yīng)的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路*

劉清華1,3△, 許言午4， 吳博威2,3

(山西醫(yī)科大學(xué)1病理生理教研室,2生理教研室,3細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太原030001；4上海中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，上海 201200)

目的探討5-HT4受體激動(dòng)劑兼5-HT3受體阻斷劑zacopride增強(qiáng)心肌內(nèi)向整流鉀電流(IK1)效應(yīng)的受體和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心室肌細(xì)胞膜IK1電流，分別觀察10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受體激動(dòng)劑間氯苯雙胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制劑 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制劑GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制劑 KT5823對(duì)zacopride 增強(qiáng)IK1的影響。結(jié)果10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑RS23597-190本身可抑制IK1電流，在預(yù)先應(yīng)用RS23597-190的基礎(chǔ)上，1 μmol/L zacopride仍可明顯激動(dòng)IK1通道，使其內(nèi)向電流(-100 mV)增強(qiáng)32.5% (P< 0.05)。10 μmol/L 5-HT3受體激動(dòng)劑m-CPBG對(duì)IK1電流無明顯影響，也不能逆轉(zhuǎn)1 μmol/L zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)(P> 0.05)。此外，5 μmol/L PKA 阻斷劑 KT5720能顯著抑制1 μmol/L zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)(P< 0.05)，而PKC 阻斷劑GF109203x和PKG阻斷劑KT5823則對(duì)1 μmol/L zacopride的效應(yīng)無明顯影響(P> 0.05)。結(jié)論Zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)作用可能經(jīng)由PKA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而不依賴于5-HT3和5-HT4受體。

內(nèi)向整流鉀通道； Zacopride； 受體，5-HT

Zacopride屬苯甲酰胺衍生物，兼有5-羥色胺4(5-hydroxytryptamine 4,5-HT4)受體激動(dòng)劑和5-羥色胺3(5-HT3)受體阻斷劑作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有促胃腸道動(dòng)力和止吐作用[1-2]。我們?cè)谝豁?xiàng)比較5-HT4受體激動(dòng)劑致心律失常副作用的研究中發(fā)現(xiàn) zacopride對(duì)正常大鼠心律和心功能均無明顯影響。Zacopride對(duì)大鼠心室肌內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier K+current,IK1)表現(xiàn)出顯著的增強(qiáng)作用，同時(shí)對(duì)Ito、ICa-L、INa等影響動(dòng)作電位的主要離子流均無顯著作用。IK1是心肌最主要的背景電流，參與靜息電位的維持和心肌動(dòng)作電位3期終末的復(fù)極。Zacopride增強(qiáng)IK1可以使細(xì)胞膜超極化，增大靜息膜電位，并縮短動(dòng)作電位時(shí)程，從而消除烏頭堿、氯化鋇中毒等因素引發(fā)的心律失常[3]。增強(qiáng)心室肌IK1有可能成為一條抗心律失常的新途徑。由于5-HT受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，因此首先要明確zacopride增強(qiáng)IK1是經(jīng)5-HT受體介導(dǎo)還是經(jīng)受體外途徑，亦或兩者兼有。磷酸化是許多離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體信號(hào)通路調(diào)節(jié)的重要機(jī)制和環(huán)節(jié)，IK1也不例外。多年來對(duì)IK1影響因素的研究表明，IK1受到PLC/ Ca2+/PKC和AC/cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的雙重調(diào)節(jié)[4-6]，而NO/cGMP/PKG信號(hào)系統(tǒng)對(duì)IK1的調(diào)節(jié)鮮有報(bào)道。Zacopride增強(qiáng)IK1的作用究竟受到何種信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)？本實(shí)驗(yàn)將采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190， 5-HT3受體激動(dòng)劑間氯苯雙胍(m-chlorophenylbiguanide，m-CPBG)、PKA 抑制劑 KT5720、PKC 抑制劑GF109203x 和 PKG抑制劑 KT5823對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響，從而探討zacopride增強(qiáng)IK1的受體與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1試劑及配制

1.1Zacopride hydrochloride、RS23597-190、m-CPBG、KT5720、GF109203x、KT5823和?；撬豳徸訲ocris。膠原酶P購自德國Bochringer Mannhein。其余均為國內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2臺(tái)氏液(mmol/L) NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38。酶液為無鈣臺(tái)氏液中加入?；撬?0，膠原酶70～100 mg/L。

1.3KB液(mmol/L) KOH 85，L-谷氨酸 50，KCl 30，?；撬?20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES 10，葡萄糖 10，EGTA 0.5，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.4IK1電極內(nèi)液成分(mmol/L) KCl 150，HEPES 5，EGTA 5.0，ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，ATP-Mg 1.0，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.3；細(xì)胞外液在臺(tái)氏液中加入CdCl20.5 mmol/L阻斷ICa-L電流。

2分離單個(gè)心室肌細(xì)胞及記錄IK1電流

選用健康成年SD大鼠(購自河北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雄性，220～250 g，術(shù)前15 min靜脈注射肝素(1 000 U/kg)，戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉后頸動(dòng)脈放血，迅速開胸取出心臟，置于4 ℃用100%氧氣飽和的無鈣臺(tái)氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流。先用無鈣臺(tái)氏液灌流8～10 min，再用酶液循環(huán)灌流15～20 min。 灌流過程中保持37 ℃恒溫，灌流壓6.86 kPa，并持續(xù)通以100%氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將其剪碎，置于KB 液中輕輕吹打得到分散的心室肌細(xì)胞，經(jīng)150 μm孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中。室溫放置2～3 h后將存放于高鉀KB液中的細(xì)胞逐步復(fù)鈣。然后取幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池(約1 mL)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10 min，待細(xì)胞充分貼壁后，用臺(tái)氏液灌流，速度約2 mL/min。電極用玻璃毛細(xì)管經(jīng)微電極拉制儀(Narishige，PP-83)分兩步拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電阻約2～5 MΩ。選取橫紋清晰的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成高阻抗封接后，用負(fù)壓破膜，進(jìn)行全細(xì)胞記錄。離子電流信號(hào)經(jīng)Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon Instrument)、Digidate 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器及Pclamp8.0采集、貯存及分析。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫25 ℃下進(jìn)行。電壓鉗方式下進(jìn)行全細(xì)胞離子流記錄。分別觀察1 μmol/L zacopride 對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)，及10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受體激動(dòng)劑m-CPBG、5 μmol/L PKA 抑制劑 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制劑GF109203x和5 μmol/L PKG抑制劑 KT5823對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1Zacopride增強(qiáng)IK1的受體通路

1.1Zacopride呈濃度依賴性增強(qiáng)IK1，1 μmol/L為其最適濃度[3]， 5-HT4受體阻斷劑RS23597-190(10 μmol/L)本身可抑制IK1，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用1 μmol/L zacopride仍可顯著激動(dòng)IK1通道，其內(nèi)向電流(-100 mV)可增大32.5% [由(- 5.10 ± 0.46) pA/pF增大至(- 6.76 ± 0.60) pA/pF，P< 0.05]，表明 zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)不是由5-HT4受體介導(dǎo)的，見圖1。

圖15-HT4受體阻斷劑RS23597-190對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響

1.21 μmol/L zacopride可顯著增強(qiáng)IK1，10 μmol/L 5-HT3受體激動(dòng)劑m-CPBG對(duì)IK1電流無明顯影響，也不能逆轉(zhuǎn)1 μmol/L zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)(P> 0.05)。表明 zacopride增強(qiáng)IK1不通過5-HT3受體途徑，見圖2。

圖25-HT3受體激動(dòng)劑m-CPBG對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響

2Zacopride增強(qiáng)IK1的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2.15 μmol/L PKA阻斷劑 KT5720能完全逆轉(zhuǎn)1 μmol/L zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)(P< 0.05)，表明zacopride可能經(jīng)由PKA信號(hào)系統(tǒng)增強(qiáng)IK1，見圖3、5。

圖3PKA阻斷劑KT5720對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響

2.25 μmol/L PKC阻斷劑GF109203x對(duì)1 μmol/L zacopride的效應(yīng)無明顯影響(P>0.05)，提示PKC信號(hào)系統(tǒng)不參與zacopride對(duì)IK1的調(diào)節(jié)作用，見圖4、5。

圖4PKC阻斷劑GF109203x對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響

2.35 μmol/L PKG阻斷劑KT5823對(duì)1 μmol/L zacopride的效應(yīng)無明顯影響(P> 0.05)，提示PKG信號(hào)系統(tǒng)也不參與zacopride對(duì)IK1的調(diào)節(jié)，見圖5。

討 論

5-HT受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，對(duì)外周組織多種器官的反應(yīng)起重要作用，包括消化道、膀胱、心臟和腎上腺，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)如認(rèn)知、情感、食欲調(diào)節(jié)、止吐和抗焦慮等方面也具有重要的作用。5-HT4受體激動(dòng)劑作為促胃腸動(dòng)力藥可以促進(jìn)胃排空、加快小腸和結(jié)腸蠕動(dòng)[7]；而5-HT3受體目前只有阻斷劑具有臨床應(yīng)用價(jià)值，用于止吐和腸易激綜合征[8]。但這些藥物在發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)的同時(shí)其致心律失常副作用也引起了普遍擔(dān)憂。已有的研究表明，5-HT4受體激動(dòng)劑和5-HT3受體阻斷劑潛在的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)與其阻斷延遲整流鉀電流(IK)有關(guān)[9-10]，使得復(fù)極延緩，QT間期延長，甚至發(fā)生致死性尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速(torsades de pointes, TDP)。Zacopride兼有5-HT4受體激動(dòng)劑和5-HT3受體阻斷劑作用，但在我們的研究中，zacppride對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠無明顯致心律失常副作用，且具有抗心律失常的療效，其離子機(jī)制為增強(qiáng)心室肌IK1，進(jìn)而增大靜息膜電位，加快動(dòng)作電位3期復(fù)極[3]。 Zacopride對(duì)IK1的特異性作用是否通過5-HT受體介導(dǎo)？這類藥物是否都具有相似的藥理學(xué)作用？我們分別觀察了5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190和5-HT3受體激動(dòng)劑m-CPBG 對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響，發(fā)現(xiàn)兩者均不能阻斷zacopride對(duì)大鼠心室肌IK1的增強(qiáng)效應(yīng)。劉清華等[11]報(bào)道另一5-HT4受體激動(dòng)劑兼5-HT3受體阻斷劑2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]benzothiazole致大鼠心律失常風(fēng)險(xiǎn)的電生理學(xué)機(jī)制為抑制IK1。綜合本文結(jié)果，zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)作用很可能是其特有的，非5-HT受體依賴性的藥理學(xué)作用。能否將IK1作為篩選安全促胃腸動(dòng)力藥和止吐藥的新指標(biāo)，將是我們下一步工作的方向。此外，5-HT4受體主要分布在心房組織，在多種動(dòng)物種屬中會(huì)介導(dǎo)心動(dòng)過速和正性變力效應(yīng)，提示內(nèi)源性5-HT4受體激活在心律失常發(fā)生中起重要作用，會(huì)導(dǎo)致心房纖顫和猝死[12]。以往認(rèn)為大鼠心室肌缺乏5-HT4受體[13]，而最近的研究顯示大鼠心室肌細(xì)胞有5-HT4受體mRNA表達(dá)，在心衰大鼠，其表達(dá)可上調(diào)4倍[14]。作為5-HT4受體激動(dòng)劑，zacopride對(duì)心房的作用有待進(jìn)一步研究；而其對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1的非受體依賴性激動(dòng)效應(yīng)，究竟是由于5-HT4受體缺如所致，抑或另有途徑，也需進(jìn)一步闡明。

Figure 5. The effects of the inhibitors of PKA, PKC and PKG on the augmentedIK1induced by 1 μmol/L zacopride. Zaco:zacopride.*P< 0.05vscontrol;#P< 0.05vsZaco.

圖5PKA、PKC和PKG阻斷劑對(duì)zacopride增強(qiáng)IK1的影響

許多研究表明PLC/Ca2+/PKC和AC/cAMP/PKA信號(hào)系統(tǒng)在IK1調(diào)節(jié)中具有作用，但各家報(bào)道不一。如Fakler等[4]認(rèn)為PKA 催化亞基可上調(diào)爪蟾卵母細(xì)胞IK1的表達(dá)，而PKC特異性激動(dòng)劑可下調(diào)IK1。Koumi等[5]發(fā)現(xiàn)純化的PKA 催化亞基下調(diào)內(nèi)源性IK1。在人心肌細(xì)胞，內(nèi)皮素(ET-1)對(duì)IK1的抑制作用可被PKC抑制劑staurosporine阻斷，但PKA特異性抑制劑 KT5720對(duì)內(nèi)皮素的作用無影響[6]。在我們的研究中，5 μmol/L KT5720可顯著抑制zacopride對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1的增強(qiáng)作用，而PKC抑制劑GF109203X和PKG抑制劑KT5823并不能逆轉(zhuǎn)zacopride對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)。這提示我們，zacopride對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1的增強(qiáng)效應(yīng)很可能經(jīng)由PKA信號(hào)系統(tǒng)介導(dǎo)，PKC和PKG信號(hào)系統(tǒng)不參與zacopride藥理學(xué)作用的調(diào)節(jié)。到目前為止，尚沒有公認(rèn)的IK1選擇性激動(dòng)劑或阻斷劑，這給IK1通道的研究帶來困擾。Zacopride 對(duì)IK1的增強(qiáng)效應(yīng)受PKA信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)則可能為我們篩選IK1藥理學(xué)工具藥提供了思路和方向。

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Receptorandsignalingmechanismsinvolvedinzacopride-inducedpotentiationofIK1

LIU Qing-hua1, 3,XU Yan-wu4, WU Bo-wei2, 3

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPhysiology,3KeyLaboratoryofCellularPhysiologyco-establishedbyMinistryofEducationofChinaandShanxiProvince,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;4DepartmentofBiochemistry,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201200,China.E-mail:liuqh20041206@163.com)

AIM: To investigate the receptor and signaling mechanisms involved in the potentiation of inward rectifier K+current (IK1) induced by zacopride, a potent 5-HT3receptor antagonist and 5-HT4receptor agonist.METHODSThe whole-cell patch clamp technique was used to recordIK1. 5-HT4-receptor antagonist RS23597-190, 5-HT3-receptor agonistm-chlorophenylbiguanide (m-CPBG), PKA inhibitor KT5720, PKC inhibitor GF109203X and PKG inhibitor KT5823 were applied respectively to determine the regulatory mechanism ofIK1.RESULTSIn the presence of RS23597-190 at concentration of 10 μmol/L which inhibitedIK1, zacopride at concentration of 1 μmol/L still increasedIK1with the mean increment of 32.5% in inward current (at -100 mV,P<0.05). TheIK1increment induced by zacopride was not inhibited bym-CPBG at concentration of 10 μmol/L (P>0.05). Furthermore, PKA inhibitor KT5720 at concentration of 5 μmol/L reversed the effect of zacopride (P<0.05), while PKC inhibitor GF109203X and PKG inhibitor KT5823 both at concentration of 5 μmol/L didn’t influence the effect (P>0.05).CONCLUSIONZacopride potentiatesIK1via a PKA-mediated signaling pathway, which is independent on 5-HT4and 5-HT3receptors.

Inward rectifier K+current; Zacopride; Receptors,5-HT

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.002

中國病理生理學(xué)會(huì)2012年活動(dòng)計(jì)劃表