莊意麗，顧慧芬

（上海市中藥研究所，上海 201401）

猴頭菌片高產(chǎn)菌株的優(yōu)選

莊意麗，顧慧芬*

（上海市中藥研究所，上海 201401）

目的：分離篩選優(yōu)質(zhì)猴頭菌菌株。方法：通過組織分離法獲得猴頭菌的純培養(yǎng)菌株，對(duì)12種不同菌株的猴頭菇菌絲長速長勢(shì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用HPLC法測(cè)定腺苷含量作為輔助方法，篩選優(yōu)質(zhì)猴頭菌菌株。結(jié)果與結(jié)論：從9個(gè)猴頭菌株中篩選出優(yōu)質(zhì)菌株，其中C-12菌株菌絲日生長速度最快，腺苷含量較高。

猴頭菌；優(yōu)良菌株；腺苷

猴頭菇（Hericium erinaceus），味甘、性平、能利五臟、助消化、滋補(bǔ)，對(duì)消化不良、神經(jīng)衰退與十二指腸潰瘍及胃潰瘍有良好的功效。是一種珍貴藥用真菌，隨著藥用真菌產(chǎn)品的開發(fā)，猴頭菇質(zhì)量的好壞，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)品穩(wěn)定有著直接影響。猴頭菌片是由單味藥猴頭菌菌絲體組成，為了篩選具有較高穩(wěn)定性的猴頭菌菌株，我們于2010年采集吉林長白山天然鮮野生猴頭菇進(jìn)行組織分離，通過純化培養(yǎng)［1-5］，篩選出菌絲生長速度快、顏色潔白、菌絲密度大的猴頭菌菌株。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道猴頭菇其有效成分為多糖類和多肽類物質(zhì)及蛋白質(zhì)、氨基酸等，還含有相當(dāng)含量的腺苷成分［6-8］。本試驗(yàn)以腺苷含量測(cè)定可作為一種輔助方法對(duì)菌絲進(jìn)行優(yōu)良鑒別?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 原材料

供試猴頭菇均采自吉林長白山天然鮮野生猴頭菇。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制作

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，自然pH值。

2.2 菌種分離和純化

以長白山天然鮮野生猴頭菇子實(shí)體作為多孢分離培養(yǎng)物。選取成熟度50%～60%的幼嫩子實(shí)體，擇優(yōu)良種菇，去雜，用75%酒精沖洗種菇表面，再用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干，通過紫外照射進(jìn)行表面消毒。切取菇體中間3 mm×3 mm左右菌塊接入培養(yǎng)基斜面中央，每種各接種10支試管，然后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察記錄菌絲體生長狀況，從中初篩出猴頭菌母種，再進(jìn)行2次復(fù)篩。

2.3 菌絲生長速度比較

平板接種法用于菌絲生長速度的測(cè)定。將篩選出的菌株接種于（PDA）平面培養(yǎng)基中，每個(gè)猴頭菇菌株設(shè)5個(gè)重復(fù)。每平板中心接一塊2 mm×2 mm左右的菌種塊，于25℃恒溫下培養(yǎng)10 d，每日觀察記錄菌絲生長狀況，篩選出生長速度快、長勢(shì)好、色澤白的優(yōu)良菌株。

2.4 腺苷含量比較

HPLC法用于測(cè)定猴頭菌絲體的腺苷含量［9］。

2.4.1 儀器與試藥 Agilent-1100高效液相色譜儀系統(tǒng)，VWD檢測(cè)器，腺苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所110879-200202），甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取恒重的腺苷對(duì)照品適量，置25 mL量瓶中，加15%甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成濃度為0.016 mg·mL－1的腺苷對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取猴頭菌絲體干粉0.1 g，加入25 mL 15%甲醇超聲提取30 min，過濾即得。上樣前用0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4.4 色譜條件與系統(tǒng)的適用性 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇 －0.01%乙酸 （9∶91）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長：260 nm；進(jìn)樣量：10μL。在以上色譜條件下測(cè)定并記錄圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株分離培養(yǎng)結(jié)果

從12個(gè)多孢分離培養(yǎng)物中分離出9株猴頭菌株。

3.2 菌絲體生長比較結(jié)果

對(duì)9個(gè)猴頭菇菌絲體生長速度的測(cè)定及其菌絲長勢(shì)的觀察，篩選出菌絲生長均勻整齊、潔白、生長快、長勢(shì)好的優(yōu)良菌株。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及方差分析顯示，猴頭菇C-12菌絲生長速度與其他菌株菌絲生長速度之間差異達(dá)極顯著水平，C-3與C-11，C-2與C-9、C-1，C-4與C-6、C-10之間差異均不顯著。C-12生長速度為（4.8±0.32）cm／10 d是長勢(shì)最好的菌株；其次是C-3和C-11；生長較慢的菌株是C-4、C-6和C-10，長勢(shì)也最差。

表1 菌絲體生長結(jié)果（n＝5）

3.3 腺苷含量比較結(jié)果

精密稱取9個(gè)猴頭菇菌絲0.1 g，按2.4.3供試品溶液的制備方法，制備成供試品溶液。以濃度為0.003 2 mg·mL－1的腺苷為對(duì)照品溶液，按2.4.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定腺苷峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

液相色譜結(jié)果表明，樣品色譜圖中，在與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰，主峰與其他色譜峰之間分離關(guān)系良好。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y＝10.324X－1.244 7，r＝0.999 9。結(jié)果表明：腺苷在0.006 4～0.096μg吸收峰的面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。從表2可以看出C-12號(hào)菌株的腺苷含量相對(duì)較高。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

4 討論

猴頭菇營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值得到廣大消費(fèi)者的認(rèn)可。為了使猴頭菌達(dá)到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)的育種目的，本試驗(yàn)采用組織分離法獲得猴頭菌母種，通過純化培養(yǎng)，篩選出菌絲生長速度快、色白、菌絲密度大的優(yōu)質(zhì)猴頭菌菌株，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，猴頭菌C-12菌株無論從菌絲長勢(shì)、腺苷含量都是極顯著好于其他菌株，可供推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)以腺苷含量可作為一種輔助標(biāo)準(zhǔn)對(duì)菌絲進(jìn)行優(yōu)良鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)猴頭菌菌絲體中的腺苷進(jìn)行了含量測(cè)定，獲得了滿意的結(jié)果，對(duì)判斷菌株的優(yōu)劣提供輔助參考方法。

［1］洪獻(xiàn)梅.香菇的菌種分離技術(shù)試驗(yàn)［J］.中國食用菌，2009，28（5）：64-65.

［2］江微，楊江華，李川.食用菌菌種分離研究進(jìn)展［J］.農(nóng)技服務(wù)，2009，26（7）：161-16.

［3］胡建偉，龔明福，賈巖峰.猴頭菌優(yōu)良菌株篩選研究初報(bào)［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2002，9（4）：44-46.

［4］陸娜，王偉科，周祖法，等.猴頭菇菌株品比篩選［J］.浙江食用菌，2009，17（3）：51-52.

［5］馬榮山，方蕊.草原白蘑菌種分離及菌絲體生長因子的篩選［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，201l，42（1）：69-73.

［6］戚雁飛.HPLC測(cè)定復(fù)方猴頭膠囊中腺苷的含量［J］.中成藥，2002，24（3）：181-183.

［7］周靜安.RP-HPLC測(cè)定復(fù)方猴頭顆粒劑中腺苷的含量［J］.中成藥，2005，27（2）：213-214.

［8］李潔莉，陸玲，陳坤，等.猴頭菌及其藥物制品腺苷等藥效成分分析［J］.中國食用菌，2002，21（3）：32-34.

［9］顧慧芬，莊意麗，張夢(mèng)玲.HPLC測(cè)定猴頭菌片中腺苷的含量［J］.中成藥，2012，34（7）：207-208.

Screen the high yielding producing strains for Hericium tablets

ZHUANG Yi-li，GU Hui-fen*
（Shanghai Institute of Chinese Materia Medica，Shanghai201401，China）

Objective：Study on screening of the high qualityHericium erinaceusstrains.M ethodsPure culture strains ofHericium erinaceuswere isolated from its body tissue.Screening of the high quality strains through evaluating the growth of12 kinds of differentHericium erinaceusstrains.Meanwhile，analyzing the contentof adenosine by HPLC was helpful for the screening.Results and ConclusionA pure culture strain named C-12 was selected out as it the highest one in growth and the content of adenosine.

Hericium erinaceus；High quality strains；Adenosine

*［通訊作者］顧慧芬，Tel：（021）37565589，E-mail：ghuif＠126.com

2012-03-22）