于翠柳，陳野，李秀明，郭立華，張寧

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

許多大豆食品的加工是利用大豆蛋白的凝膠化制作的，例如制作豆腐、酸乳酪等[1]，大豆蛋白凝膠的形成與多種因素有關(guān)，如大豆的化學(xué)性質(zhì)、豆?jié){中的固形物的含量[2]及凝固劑的濃度[3]等，許多科研人員研究了大豆蛋白凝膠的形成機(jī)理，李里特[4]等研究了豆腐的加工工藝以及鹽類凝固劑的凝固特性與作用機(jī)理，考察了基本的加工條件對豆腐凝膠強(qiáng)度的影響。大豆蛋白凝膠形成的實質(zhì)就是大豆蛋白在凝固劑的作用下相互結(jié)合，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將脂肪、水等成分包容在一起[5]，這研究的是大豆蛋白凝膠的綜合特性。凝膠的形成有眾多的影響因素，為了減小脂肪、糖等成分對凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響，本實驗采用大豆分離蛋白作為原料來制備大豆蛋白凝膠，研究其凝膠形成特性。大豆蛋白凝膠的工藝以及工藝參數(shù)對凝膠質(zhì)構(gòu)影響的研究已經(jīng)很多，但這些條件對凝膠顯微結(jié)構(gòu)影響研究還不深入，本文采用鹽鹵、葡萄糖酸內(nèi)酯和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為凝固劑制備大豆蛋白凝膠，采用戊二醛和乙醇作為固定劑來固定凝膠的結(jié)構(gòu)，冷凍干燥后測定其硬度并觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：平頂山植物蛋白有限公司。

鹽鹵：天津利民調(diào)料有限公司；葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL）：江蘇康力生物科技發(fā)展有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）：江蘇一鳴生物制品有限公司；戊二醛：天津博迪化工股份有限公司；乙醇：天津市江天化工技術(shù)有限公司（均為分析純）。

1.1.2 儀器

KDM型調(diào)溫電熱套：A型，山東省鄄城永興儀器廠；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；MODULYOD-230型冷凍干燥機(jī)：美國熱電公司；TAXT plus型物性分析儀：北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；SU1510型掃描電子顯微鏡：日本那珂事業(yè)所。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白凝膠的制備

配制質(zhì)量比為6%的生蛋白溶液，加熱至100℃并保持10 min，得到熟蛋白溶液。

取300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中，與不同濃度（質(zhì)量體積比分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）的鹽鹵混合3 min，將混合物迅速轉(zhuǎn)移到80℃的水浴鍋中保溫凝固30 min，制得鹽鹵處理的大豆蛋白凝膠，然后快速冷卻到20℃，最后儲放在4℃冷藏箱內(nèi)備用。

另取30℃以下300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中，與不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L）的葡萄糖酸內(nèi)酯混合3 min，其他的操作同鹽鹵，制得葡萄糖酸內(nèi)酯處理的大豆蛋白凝膠。

取300 mL、50℃熟蛋白溶液倒入含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（10、20、30、40、50 kat/g）的燒杯中，將其置于 50 ℃的水浴鍋中3 h。制得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的大豆蛋白凝膠。

1.2.2 大豆蛋白凝膠的固定和干燥

大豆蛋白凝膠切成長條（65 mm×15 mm×15 mm），在一定濃度的固定劑溶液（不同濃度的戊二醛或100%乙醇）中固定24 h。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次10min。用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脫水，每種濃度的乙醇各處理10 min。經(jīng)脫水后，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。

1.2.3 掃描電鏡觀察

干燥后的凝膠置于液氮中脆斷，處理好后粘在金屬樣品臺上，斷裂面向上，采用離子濺射方法鍍金，鍍金的條件為15 kV、15 mA、1.5 min。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡（15 kV）下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 大豆蛋白凝膠硬度測定

冷凍干燥后的大豆蛋白凝膠放在物性分析儀上做硬度實驗，采用A/WEG探頭（30°角精細(xì)鍥型刀具），測試速度為2.0 mm/s，凝膠硬度是指探頭切斷凝膠時所受到的最大的力，儀器讀數(shù)單位為g。每種凝膠測定5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 處理方法對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 凝固劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

表1表示的是選取任意不同的凝固劑處理的凝膠樣品單位面積（1μm2）內(nèi)網(wǎng)孔的個數(shù)以及直徑。

表1 不同的凝固劑處理下的凝膠網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)孔的個數(shù)及直徑Table 1 Number and diameter of holes in the gel network treated by different coagulants

從表1可以看出，隨著鹽鹵的加入，網(wǎng)孔的個數(shù)增多，這是因為鹽鹵中的高價陽離子與大豆蛋白表面帶負(fù)電荷的氨基酸殘基結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)間的靜電斥力減弱，當(dāng)大豆蛋白溶液中的鹽離子達(dá)到凝固濃度時，蛋白質(zhì)之間的斥力和引力達(dá)到平衡，蛋白質(zhì)結(jié)合成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；0.7%鹽鹵形成凝膠的網(wǎng)孔的個數(shù)最多，孔徑有減小趨勢，孔徑均等于或小于1μm，其原因為：隨著鹽鹵濃度的進(jìn)一步增加，正離子對蛋白的靜電屏蔽作用增強(qiáng)，使得大豆蛋白分子之間的斥力進(jìn)一步降低，引力增加，于是蛋白相互結(jié)合的速率加快，形成的網(wǎng)孔變多，孔徑略有減小。

對于葡萄糖酸內(nèi)酯制備的凝膠樣品來說，隨著葡萄糖酸內(nèi)酯濃度的增加，網(wǎng)孔個數(shù)先增后減，0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯形成凝膠的孔的個數(shù)最多，孔徑呈減小趨勢，其原因為：當(dāng)加入葡萄糖酸內(nèi)酯后，葡萄糖酸內(nèi)酯逐漸水解產(chǎn)生H+，使蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷減小，分子間的靜電斥力減弱，當(dāng)葡萄糖酸內(nèi)酯的濃度達(dá)到一定程度時，在疏水相互作用等引力的作用下，蛋白分子逐漸結(jié)合到一起，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。GDL濃度高于0.06 mol/L后，葡萄糖酸內(nèi)酯進(jìn)一步水解產(chǎn)生H+，大豆蛋白分子電荷量繼續(xù)減小，分子間的結(jié)合力相對來說加強(qiáng)，蛋白分子相互結(jié)合的速率加快，容易堆扎在一起，孔的個數(shù)就會減少，孔徑也變小。

此外，對于應(yīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠樣品來說，TGase濃度是40 kat/g時，網(wǎng)孔的數(shù)量最多，孔徑最小。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，簡稱TGase，全稱是蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶）是一種能夠催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間結(jié)合反應(yīng)的酶，蛋白或多肽之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物，其中蛋白質(zhì)（或多肽）交聯(lián)所產(chǎn)生的橋叫做ε-（γ-谷氨酰胺基）賴氨酸鍵（G-L鍵）[6]。Chanyongvorakul等[7]報道大豆蛋白在TGase的作用下，酸性亞基能夠交聯(lián)而被聚合。Sakamo[8]測定了TGase酶促反應(yīng)物ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸的含量，證明賴氨酸的含量隨著該酶濃度的升高而升高，這和本實驗中低酶濃度時的變化一致。TGase濃度升到50 kat/g時，凍干凝膠孔的個數(shù)迅速減少，孔徑也很小，說明維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定所需的共價鍵的數(shù)目具有一定的飽和性，過多的酶量反而不利于凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖1是3種凝固劑處理的凝膠中網(wǎng)孔個數(shù)較多的凝膠樣品的SEM圖，圖1a是0.7%鹽鹵處理的凝膠的SEM圖，圖1b是0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的SEM圖，圖1c是40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的SEM圖。

圖1 不同凝固劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)（均由2.5%戊二醛固定）Fig.1 Microstructure of gels treated by different coagulants(all of gels were fixed by 2.5%glutaraldehyde)

由圖1可見，采用2.5%戊二醛固定凝膠結(jié)構(gòu)的條件下，用3種凝固劑制備的大豆蛋白干凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有很大的差異：鹽鹵處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較粗疏、網(wǎng)孔大小不均且分布不均（圖1a），葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密程度高、網(wǎng)孔較小且均勻（圖1b），轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與葡萄糖酸內(nèi)酯處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相似，但其孔徑更?。▓D1b孔徑為 0.3μm，圖 1c孔徑為 0.1μm）。

2.1.2 固定劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

為了真實反映大豆蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)，采用固定劑固定其結(jié)構(gòu)。常用的固定劑有乙醇、冰醋酸、甲醛、戊二醛等，戊二醛是蛋白質(zhì)的強(qiáng)固定劑，但由于其毒性，故本實驗采用了100%乙醇作為固定劑，與戊二醛固定凝膠的結(jié)構(gòu)做對比，以觀察乙醇的固定效果。

圖2是由0.7%鹽鹵制備的大豆蛋白凝膠的SEM圖。

圖2 不同固定劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)（凝固劑均為0.7%鹽鹵）Fig.2 Microstructure of gels treated by different fixatives(coagulant of gels was 0.7%brine)

由圖2可見，2.5%和6%戊二醛的固定效果相似，由此判斷，不同濃度的戊二醛對凝膠的顯微結(jié)構(gòu)無顯著影響；100%乙醇同樣能夠起到很好的固定效果，乙醇是一種極性有機(jī)溶劑，羥基中的H帶正電，O帶負(fù)電，可分別與大豆蛋白分子中的相反電荷作用，降低蛋白質(zhì)分子間的無序凝聚，有利于形成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.2 凝固劑和固定劑對凝膠硬度的影響

凝膠強(qiáng)度是大豆蛋白凝膠的一個很重要的參數(shù)，也反映出蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度，因此采用凝膠的硬度來反映其強(qiáng)度的大小。圖3是鹽鹵處理的凍干凝膠的硬度。

圖3 鹽鹵和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of brine and fixatives on the hardness of the gel

由圖3可見，同種固定劑固定的凝膠硬度隨著鹽鹵濃度的增加變化不大，不同的固定劑能對凝膠硬度產(chǎn)生顯著影響，100%乙醇固定的凝膠的硬度最大（約2500g），其次是6%戊二醛固定的凝膠硬度（約2000g），2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1500 g）。100%乙醇固定的凝膠硬度最大，分析原因是：乙醇分子通過羥基OH和蛋白分子之間形成氫鍵，提高了大豆蛋白分子定向排列的有序性，因此用乙醇固定凝膠的硬度有顯著的提高。

2.5%和6%的戊二醛對凍干后凝膠的硬度有顯著影響，故進(jìn)一步對中間濃度3.5%、4.5%、5.5%戊二醛處理的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠的硬度進(jìn)行檢測，觀察不同濃度的戊二醛處理的凝膠硬度是否有明顯區(qū)別。100%乙醇固定的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠凍干后碎成小塊，故無法進(jìn)行硬度測定。

圖4 葡萄糖酸內(nèi)酯和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.4 Effect of GDL and fixatives on the hardness of the gels

由圖4可見，葡萄糖酸內(nèi)酯濃度對凝膠硬度的影響不大，而不同濃度的戊二醛能對凝膠硬度產(chǎn)生明顯的影響，硬度隨著戊二醛濃度的增加而增大，2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1000 g），6%戊二醛處理的凝膠硬度最大（約3500 g）。

凝膠的顯微結(jié)構(gòu)直接影響著其物理特性，大豆蛋白凝膠不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了強(qiáng)度的變化。網(wǎng)孔越致密，強(qiáng)度越高。由表1分析得知0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠具有最致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，0.1 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠有最少的網(wǎng)孔和最小的孔徑，因此0.1mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的硬度是最大的。

圖5 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of TGase and fixatives on the hardness of the gels

圖5是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的硬度。隨著TGase酶量的增加，凍干凝膠的硬度逐漸增加，這說明形成的GL肽鍵在空間結(jié)構(gòu)上提高了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械性能，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。6%戊二醛固定的凝膠硬度明顯高于2.5%戊二醛固定的凝膠硬度。

3 結(jié)論

通過對不同的凝固劑和固定劑作用下形成大豆蛋白凝膠顯微結(jié)構(gòu)和硬度的測試與觀察分析，結(jié)果表明：大豆蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是由凝固劑決定的，由0.7%鹽鹵、0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯、40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠有較多的網(wǎng)孔個數(shù)；大豆蛋白凝膠的硬度與凝固劑和固定劑的濃度有關(guān)，其中固定劑對凝膠硬度的影響顯著，100%乙醇固定的凝膠的硬度最大，其次是6%戊二醛固定的凝膠的硬度。

以上數(shù)據(jù)為大豆蛋白凝膠制備的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考，也為大豆蛋白凝膠在組織工程支架材料方面的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。另外，通過研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在凝膠形成中的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)該酶適合于制備大豆蛋白凝膠，這將是大豆蛋白凝膠方面新的研究方向。

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