酸馬奶分離到的乳酸菌分子鑒定

金山，白雅莉，趙洪鑫，芒來

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古科技信息研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蒙醫(yī)藥典中記載：“酸馬奶味酸、甘、澀?！彼崮荛_胃、助消化、祛濕、行氣，甘能健身補(bǔ)弱、疏通食道、治傷、接骨、解毒、增強(qiáng)五官功能，澀能治血熱、化淤血、消肥胖、祛腐生肌、潤(rùn)皮膚[1]。在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)，酸馬奶具有降血脂[2]、降膽固醇[3]、降血壓、治療便秘、抑制結(jié)核菌生長(zhǎng)、貧血和改善糖尿病等功效。為了研究這些功效產(chǎn)生的因素，中外學(xué)者分別對(duì)酸馬奶的成分、微生物群組成、酸度、蛋白質(zhì)成分、微量元素組成等進(jìn)行了詳盡的研究。根據(jù)酸馬奶擁有馬奶所不具備的功效，而其成分最大的不同是由酸馬奶中微生物群體造成的；酸馬奶中微生物群的構(gòu)成成為了研究重點(diǎn)，已經(jīng)得出的研究成果中，其結(jié)論各不相同，大體上以酵母菌菌群和乳酸菌菌群為主。本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)為酸馬奶中的乳酸菌。

國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)酸馬奶中的微生物進(jìn)行了研究，其分離結(jié)果均不相同。日本學(xué)者Ishii等從中國(guó)內(nèi)蒙古的酸馬奶樣品中分離到了包括乳酸桿菌Lb.paracasei subsp.paracasei亞種、Lb.rhamnosus和Lb.curvalus等乳酸菌及乳酒假絲酵母和馬克斯克魯維酵母等乳糖發(fā)酵酵母[4]。賀銀鳳等從15份酸馬奶樣品中分離出乳酸桿菌Lb.casei subsp.casei、Lb.sanfranciso、Lb homohiochii、Lb.sharpeae、Lb.jenesenii和Lb.maltaromicus，球菌Lc.mesenteroedes subsp.dextranium、E.faecalis、Laccoccus lactis、Streptococcus、E.durand等，以及酵母菌共53株[5]。Ying AN等對(duì)分離自中國(guó)內(nèi)蒙古酸馬奶中的乳酸菌進(jìn)行了研究，認(rèn)為以L.plantarum和L.pentosus為主[6]。李少英等從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的酸馬奶樣品中分離到乳酸桿菌L.acidophilus和L.casei共12株[7]。石井等從蒙古國(guó)酸馬奶中分離到的乳酸桿菌以L.plantarum為優(yōu)勢(shì)菌[8]。Burentegusi等從內(nèi)蒙古酸馬奶樣品中也分離到L.paracasei subsp.paracasei、L.coryniformis subsp.coryni formis、L.curvatus、L.kefiranofaciens等同型發(fā)酵乳酸菌[9-10]。孫天松等從新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離得到152株菌株，分別為：Lactobacillus helveticus（占總分離株的51.3%），其次為L(zhǎng).acidophilus（18.4%）和L.casei subsp.pseudoplantarum（8.6%），以及L.gasseri、L.casei subsp.casei、L.curvatus、L.sanf rancisco、L.coryniformis subsp.coryniformis、L.brevis、L.plantrum、L.homohiechill、L.fermentum、L.dellbrueckii subsp.bulgaricu、L.ruminis、L.crispatus、L.farciminis和L.hilgardii等數(shù)量較少（1株～4株）的菌株[11]。

酸馬奶中的微生物類群比較復(fù)雜，在不同地區(qū)、不同家庭中以傳統(tǒng)方法制作的酸馬奶中微生物成分不同。酸馬奶所具有的醫(yī)療保健作用與其所含有的微生物菌群有著密切的關(guān)系。因此，在本實(shí)驗(yàn)的研究過程中，仍然需要繼續(xù)進(jìn)行酸馬奶中乳酸菌的分離與鑒定。由于分子鑒定比較快捷和準(zhǔn)確，逐漸成為鑒定菌種的常用方法。本實(shí)驗(yàn)采用分子鑒定對(duì)從酸馬奶中分離得到的11株乳酸菌進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗的3份酸馬奶樣品中分離的11株乳酸菌。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉（SDS）：Sigma公司分裝；三氯甲烷（Chloroform）、異戊醇（Isopentanol）、無水乙醇（Ethanol）：A.R，天津化學(xué)試劑二廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris）：Promega Corporation,USA；硼酸：北京市新光化學(xué)試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）：華美生物工程公司；Tris飽和酚：北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；瓊脂糖（Agrose）：TAKARA分裝；超級(jí)2×Taq Master Mix，是一種可以立即使用的PCR預(yù)混液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)Taq酶反應(yīng)緩沖液及染料，使用時(shí)只需要在溶液中加入模板和引物即可?；旌弦褐泻袖宸铀{(lán)染料，PCR反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳：南京博爾迪生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)：ALPHA INNOTECH公司；電泳儀、水平電泳槽：北京六一儀器廠；9700型PCR儀：美國(guó)PERKIN ELMER公司；高速立式冷凍離心機(jī)：BECKMAN公司；220V穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀：南京大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌培養(yǎng)及基因組DNA提取

將冷凍保存的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24 h，經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代3次后，取5 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的具體培養(yǎng)物，3000 r/min離心5 min收集菌體?；蚪MDNA的提取方法采用CTAB法[6]，流程如圖1。

圖1 基因組DNA提取流程圖Fig.1 The flow chart of DNA genome extracting

1.2.2 16s rDNA基因擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)所需引物選自參考文獻(xiàn)[12]，預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為1500 bp左右。

P1（上游引物）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

P2（下游引物）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′

本實(shí)驗(yàn)所建立的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表1、2。

表1 PCR反應(yīng)體系及用量Table 1 The composition and quantities of PCR

表2 PCR擴(kuò)增條件Table 2 The optimized conditions of PCR

1.2.3 目的基因的純化回收、克隆

目的基因的純化回收采用多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行，克隆采用pGM-T克隆試劑盒（北京天根生物有限公司）進(jìn)行。將菌液送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析方法

利用BLAST，將所測(cè)定的菌株序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，尋找與目的基因序列同源性最高的已分類的菌種，然后提取該菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列（菌株序列名稱見表3），利用軟件MEGA進(jìn)行序列分析，以鄰域連接法（Neighber join，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終進(jìn)行菌種鑒定。

表3 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的乳酸桿菌菌株Table 3 The standard strains of the NJ tree

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定結(jié)果

2.1.1 目的基因電泳檢測(cè)結(jié)果

目的基因電泳檢測(cè)結(jié)果，見圖2。

圖2 目的基因電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of target gene

2.1.2 測(cè)序結(jié)果分析

將測(cè)序結(jié)果利用軟件MEGA進(jìn)行序列分析，比對(duì)結(jié)果如下。

經(jīng)比對(duì)，將11株測(cè)序菌株判定為瑞士乳桿菌，與已知的瑞士乳桿菌序列（見表4）比對(duì)，其突變位點(diǎn)如圖3。

表4 已知16 S rRNA/rDNA序列的瑞士乳桿菌菌株Table 4 The Lactobacillus helueticus strains with known 16S rRNA/rDNA sequence

將所測(cè)菌株序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所測(cè)菌株中菌株17、37和51為一支，菌株4、24、29、30、39、63、64和66為一支，而且均與瑞士乳桿菌菌株的同源性較高，初步將這11株菌株判定為瑞士乳桿菌。將這11株菌株與已知的瑞士乳桿菌序列進(jìn)行堿基序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株之間堿基差異較大的位點(diǎn)為170、508、725、1220，且都為C-T之間的轉(zhuǎn)換。

3 討論

酸馬奶中的微生物類群比較復(fù)雜，在不同地區(qū)、不同家庭中以傳統(tǒng)方法制作的酸馬奶中微生物成分不同。本實(shí)驗(yàn)所用酸馬奶的酸度較高，其pH為3.8，對(duì)其中的微生物群體進(jìn)行分離鑒定，得到了以瑞士乳桿菌為主的菌群。本文中，對(duì)其中的11株菌株進(jìn)行了16 S rDNA同源性分析，得出：這11株菌株均為瑞士乳桿菌，且目的片段僅在個(gè)別可變位點(diǎn)上有區(qū)別，同源性較高。

圖3 基于16 S rDNA序列建立的菌株NJ樹Fig.3 The NJ tree of the strains based on the 16S rDNA sequence

圖4 16 S rRNA/rDNA部分堿基序列Fig.4 The sequence of 16S rRNA/rDNA

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