張勝坤 呂杰強(qiáng) 程 靜

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種多病因的、涉及多系統(tǒng)的疾病。蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，為對(duì)PCOS進(jìn)行深入研究提供了新的途徑和思路。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)以及在PCOS中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)

從基因水平上并不能闡明疾病的動(dòng)態(tài)變化，蛋白質(zhì)組學(xué)就應(yīng)運(yùn)而生。它以生物體內(nèi)的全部蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，可以全面的、動(dòng)態(tài)的掌握生物體內(nèi)不斷變化的蛋白質(zhì)成分及功能狀態(tài)。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)主要有凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)。二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D－PAGE)以電荷的差異、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的不同為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)蛋白樣品的變性、等電聚焦分離等步驟，膠條上會(huì)出現(xiàn)不同蛋白質(zhì)條帶。再將膠條放在含十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠上，由于其相對(duì)分子質(zhì)量不同而分離。分離后的蛋白質(zhì)條帶通過(guò)差減處理，便可展示出不同蛋白樣品之間的差異。2D－PAGE只是一種重要的描述性技術(shù)，分離出來(lái)的蛋白質(zhì)缺少必要的鑒定工具時(shí)，在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用就會(huì)受到限制?；|(zhì)輔助的激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix－assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF －MS)技術(shù)出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，它是將樣品和小分子的基質(zhì)混合在一塊，并且基質(zhì)包圍在樣品周圍。這樣再經(jīng)過(guò)激光脈沖輻射，被結(jié)合的蛋白質(zhì)就解析形成荷電離子。因?yàn)橘|(zhì)荷比不同，這些離子在真空?qǐng)鲋酗w行的時(shí)間長(zhǎng)短不一樣，從而繪制出質(zhì)譜圖。20世紀(jì)90年代初期，Hutchens等［1］提出表面增強(qiáng)激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface－enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry technology，SELDI－TOF－MS)，蛋白質(zhì)分離技術(shù)又上了新的臺(tái)階，這一技術(shù)應(yīng)用了獨(dú)特的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，使得它可以更廣泛的應(yīng)用在疾病發(fā)生機(jī)制的研究上，特別是在惡性腫瘤上應(yīng)用方面。已有不少學(xué)者應(yīng)用SELDI等技術(shù)來(lái)研究前列腺癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌的診斷，并篩選腫瘤標(biāo)志物［2～5］。近些年來(lái)，越來(lái)越多的研究者應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)來(lái)研究非惡性腫瘤，Wang等［6］2007年首次將SELDI技術(shù)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥的研究，建立了子宮內(nèi)膜異位癥的血清學(xué)診斷模型，子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜的診斷模型和子宮內(nèi)膜異位癥的腹腔積液診斷模型。

二、多囊卵巢綜合征

PCOS是一種遺傳異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病，稀發(fā)排卵或無(wú)排卵(anovulation)、高雄激素血癥(hyperandrogenism)、肥胖及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是其特征。育齡期婦女PCOS發(fā)病率為5% ～10% ，是引起無(wú)排卵性不孕的主要原因。其發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)分泌、代謝、遺傳因素和胚胎發(fā)育等，還受環(huán)境因素的影響。PCOS的診斷一般采用2003年歐洲人類生殖和胚胎與美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)的(ESHRE/ASRM)鹿特丹專家會(huì)議推薦的標(biāo)準(zhǔn):①稀發(fā)排卵或無(wú)排卵;②高雄激素的臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥;③超聲表現(xiàn)為多囊卵巢［一側(cè)或雙側(cè)卵巢有12個(gè)以上直徑為2～9mm的卵泡，和(或)卵巢體積＞10ml］;④上述3條中符合2條，并排除其他高雄疾病如先天性腎上腺皮質(zhì)增生(CAH)、庫(kù)興綜合征、分泌雄激素的腫瘤。但美國(guó)雄激素過(guò)多協(xié)會(huì)(AES)也提出了自己的標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，對(duì)多囊卵巢綜合征的研究有很大進(jìn)展，Dunaif等［7］發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗是很多 PCOS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，也有學(xué)者研究稱瘦素和抑制素在多囊卵巢綜合征的發(fā)生發(fā)展中起到了很重要的作用［8，9］。雖然如此，PCOS仍面臨很多的挑戰(zhàn)，不僅其具體發(fā)病機(jī)制還不清楚，而且在臨床上還面臨很多的困惑:①至今PCOS還沒(méi)有一個(gè)很完美的診斷標(biāo)準(zhǔn);②多毛的診斷及超聲對(duì)多囊卵巢的判斷帶有很大的主觀性;③PCOS病人常常有高雄激素的生化證據(jù)，但健康婦女與PCOS病人的生化數(shù)值有明顯的重疊;④不是所有的PCOS的婦女都會(huì)出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)或者閉經(jīng)的原因尚不明確;⑤PCOS病人，對(duì)其長(zhǎng)期并發(fā)癥如2型糖尿病、子宮內(nèi)膜癌及心血管疾病的發(fā)病還缺乏有效的預(yù)測(cè)。

三、蛋白質(zhì)組學(xué)在多囊卵巢綜合征中的應(yīng)用

由于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為上述挑戰(zhàn)和困惑的解決帶來(lái)機(jī)遇。最近幾年，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者應(yīng)用其來(lái)研究多囊卵巢綜合征。研究材料包括卵巢組織、血清、外周血T淋巴細(xì)胞、卵泡液、網(wǎng)膜組織、卵巢顆粒細(xì)胞［10～14］。這些研究發(fā)現(xiàn):PCOS婦女與正常婦女相比，表達(dá)出很多差異蛋白。研究者查詢相應(yīng)生物信息庫(kù)發(fā)現(xiàn):這些差異蛋白涉及纖溶系統(tǒng)、血栓形成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞復(fù)制、呼吸和細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號(hào)、免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、代謝、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、脂肪代謝、膽固醇及細(xì)胞骨架等。

傳統(tǒng)的研究方法已經(jīng)表明多囊卵巢綜合征發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、纖溶系統(tǒng)、血栓形成、脂肪代謝和凋亡等有關(guān)，而上述應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法一方面證明了以前的研究，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些新的可能機(jī)制，如抗氧化途徑、免疫反應(yīng)等。

抗氧化途徑:有3個(gè)研究涉及抗氧化通路［12，13］，這些抗氧化因子是過(guò)氧化物酶基因－1(peroxidase gene－1)、過(guò)氧化物酶基因 －2異構(gòu)體(peroxidase gene－2 isoform)，谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 M3(glutathiones transferase，GSTM3)，熱休克蛋白 27(heat shock protein27，HSP27)。過(guò)氧化物酶基因－1是一種抗氧化酶，參與控制細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。在Borro等［12］的研究中，PCOS婦女的T淋巴細(xì)胞中過(guò)氧化物酶基因－1是上調(diào)的，這表明氧化應(yīng)激參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展。過(guò)氧化物酶基因－2異構(gòu)體具有抗氧化活性，在PCOS婦女網(wǎng)膜組織中的表達(dá)下降，這使得過(guò)氧化氫濃度增高，考慮到過(guò)氧氫具有引起的DNA破壞的作用，這或許可以部分解釋多囊卵巢患者容易發(fā)展成子宮內(nèi)膜癌的原因。與過(guò)氧化物酶基因－2異構(gòu)體表達(dá)下降相反，GSTM3的表達(dá)卻是增高的，GSTM3也是一種抗氧化酶，在細(xì)胞中，不僅參與細(xì)胞毒性物質(zhì)的降解，而且還與白三烯、前列腺素、睪酮及孕酮的合成有關(guān)。另外，在脂肪細(xì)胞的過(guò)氧化中可以通過(guò)解毒作用起到保護(hù)細(xì)胞的作用。HSP27可以抑制活性氧的產(chǎn)生，它在PCOS婦女的卵巢中是減少的［10］。我國(guó)學(xué)者秦芬等在利用質(zhì)譜技術(shù)研究PCOS時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn):HSP70在PCOS婦女血清中的表達(dá)下降。

最近的研究還發(fā)現(xiàn)參與免疫、炎癥反應(yīng)的某些因子在PCOS婦女身上也發(fā)生了變化。諾丁漢大學(xué)Matharoo－Ball等，利用一種新型反相固相提取技術(shù)結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳并借助雙相凝膠電泳、MALDI－TOF－MS等蛋白質(zhì)組平臺(tái)及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)研究PCOS病人，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C4a3c鏈、C4鏈 和觸珠蛋白的表達(dá)與正常婦女的表達(dá)不同。補(bǔ)體C4a3c鏈的表達(dá)是上升的，并且其后的Western blotting驗(yàn)證了這一點(diǎn)。這表明，這3個(gè)胰蛋白酶片段可能屬于補(bǔ)體C4途徑，當(dāng)然，這還需要更進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。還有一些因子，如Raf激酶抑制蛋白、Rho鳥(niǎo)苷二磷酸鹽解離抑制因子－1、過(guò)氧化物酶基因－1、F－肌動(dòng)蛋白α1亞基抗體、人肌動(dòng)蛋白素－1、膜聯(lián)蛋白V也直接或間接與免疫及炎癥反應(yīng)有關(guān)［12，14］。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)既可以應(yīng)用于PCOS發(fā)病機(jī)制的研究，還可以用于篩選生物標(biāo)志物，并應(yīng)用這些標(biāo)志物來(lái)診斷PCOS。喬杰等［11］以血清為標(biāo)本，利用SELDI質(zhì)譜技術(shù)，建立了有胰島素抵抗的PCOS婦女與正常婦女、無(wú)胰島素抵抗PCOS與正常婦女及有胰島素抵抗與無(wú)胰島素抵抗PCOS診斷模型來(lái)診斷PCOS。這些模型的精確性、特異性、敏感性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均在80% ～90%之間，其中有胰島素抵抗和無(wú)胰島素抵抗的PCOS婦女中存在19個(gè)差異蛋白，其中M/Z為6629d差別最明顯，僅這一差異蛋白用來(lái)區(qū)別有胰島素抵抗的病人與正常婦女，其精確性、特異性、敏感性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為63.33%、70.00%、56．67%、68．18%;Matharoo － Ball等的研究得出的結(jié)果也證實(shí)了質(zhì)荷比(m/z)為8674、8668、1351、8727、8673、6871 的 6 個(gè)生物標(biāo)志物用來(lái)區(qū)分PCOS婦女和正常婦女，其敏感性為90．4%，質(zhì)荷比為2924、3025、1977的敏感性更是達(dá)到了100%。對(duì)這些質(zhì)荷比值做進(jìn)一步研究，理論上說(shuō)會(huì)發(fā)現(xiàn)一種或數(shù)種因子可以有效的診斷PCOS，甚至可以代替目前主觀性很高的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

四、問(wèn)題及展望

近些年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)蓬勃發(fā)展，但作為新興的學(xué)科還面臨很多問(wèn)題和挑戰(zhàn)。從技術(shù)本身上來(lái)說(shuō)，SELDI或者M(jìn)ALDI可能存在假陽(yáng)性的問(wèn)題，也就是說(shuō)發(fā)現(xiàn)的差異蛋白也許不是疾病本身造成的，而是受到了其他因素的影響。在臨床應(yīng)用中也存在很多問(wèn)題，例如在PCOS的研究應(yīng)用中，技術(shù)方面不僅有雙向電泳凝膠技術(shù)，還有SELDI、MALDI質(zhì)譜技術(shù);研究的材料來(lái)更是包括血清、網(wǎng)膜組織、卵巢組織、外周血T淋巴細(xì)胞、卵泡液等，多種技術(shù)和多種組織缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，也就缺乏強(qiáng)有力的說(shuō)服力。另外，他們所研究對(duì)象數(shù)目比較少(實(shí)驗(yàn)對(duì)象數(shù)目3～30個(gè))，目前還缺乏大規(guī)模的研究數(shù)據(jù)。總體上蛋白質(zhì)組學(xué)在PCOS中的研究還處在起步階段，但隨著生物信息學(xué)等相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)將在PCOS中有更多的、更深入的應(yīng)用。相信Atiomo等［10］關(guān)于建立PCOS專用蛋白質(zhì)組學(xué)生物信息庫(kù)的設(shè)想也會(huì)實(shí)現(xiàn)。

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