姜 娟

山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院萊山分院 264000

喉癌的治療主要是放射療法和外科手術(shù)，為了提高療效，筆者對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌采用化療，可以抑制或殺死殘存的腫瘤細(xì)胞，減少局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］。絲裂霉素（Mitomycin）別名：自力霉素，深紫色結(jié)晶性粉末。水溶液pH6～9時(shí)較穩(wěn)定。在細(xì)胞內(nèi)通過還原酶活化后起作用，可使DNA解聚，同時(shí)阻斷DNA的復(fù)制。高濃度時(shí)對(duì)RNA和蛋白質(zhì)的合成亦有抑制作用。主要作用于晚G1期和早S期。耐藥主要由細(xì)胞膜通透性降低，以致細(xì)胞內(nèi)濃度下降。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep－2細(xì)胞株由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物室贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及配制［2］絲裂霉素為浙江海天藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，青霉素為山東魯抗藥業(yè)公司生產(chǎn)，鏈霉素為瑞陽藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）美國(guó)sigma公司 ，RPMI－1640粉10.39g。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器 日本產(chǎn)DEV5酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；SW－CJ－IF醫(yī)用凈化工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；HERAcellRCO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品；普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡PM－10AD及相機(jī)IMT－2均為日本Olympus公司產(chǎn)品；醫(yī)用低溫冰箱（SANYO）；YXQG02型電熱式蒸汽消毒器為山東新華醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)［3］

1.4.1 取材：在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中。

1.4.2 人喉鱗狀細(xì)胞癌 Hep－2細(xì)胞正常培養(yǎng)：培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100μ／ml青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，全部實(shí)驗(yàn)均選用指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于相適應(yīng)的培養(yǎng)板中。

1.4.3 MTT法測(cè)定 MMC對(duì) Hep－2細(xì)胞存活率的影響：MTT法的作用原理：細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑蘭（MTT）還原為紫色的結(jié)晶物（Formazaman）并沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，通過比色測(cè)定結(jié)晶量記錄結(jié)果，并按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組光吸收值／對(duì)照組光吸收值×100%。結(jié)晶量的多少可以反映出活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力及細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)等多種指標(biāo)。

1.4.4 nm23免疫組化染色：采用nm23免疫組化染色試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）對(duì)Hep－2細(xì)胞中的nm23抗轉(zhuǎn)移基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hep－2細(xì)胞 MMC作用后活細(xì)胞計(jì)數(shù) Hep－2細(xì)胞MMC處理后，結(jié)果表明，正常培養(yǎng)的細(xì)胞極少出現(xiàn)臺(tái)盼藍(lán)陽性染色的細(xì)胞。處理3h、6h，臺(tái)盼藍(lán)陽性染色細(xì)胞未見明顯增加；12h后染色的比率達(dá)到（19±4.2）%，24h后，陽性細(xì)胞為（69±3.1）%，表明12h后有細(xì)胞死亡，24h后大部分死亡，48h后基本死亡。

2.2 MTT對(duì)細(xì)胞存活率的檢測(cè) 四唑鹽（MTT）比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。外源性的MTT能將活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，這種還原能反映出線粒體良好的功能，細(xì)胞數(shù)量越多，表現(xiàn)出總的還原能力越強(qiáng)。MTT指標(biāo)還反映細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)處于氧化壓力條件下，導(dǎo)致對(duì)MTT還原能力的減弱。Hep－2細(xì)胞在MMC處理3h后，MTT的值約為對(duì)照組的一半，然后MTT值呈漸進(jìn)性下降（Fig.1.5），結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 及 臺(tái) 盼 藍(lán) 拒 染 分 析（Fig.1.6），MMC刺激的開始幾小時(shí)內(nèi)，MTT 值的下降是細(xì)胞內(nèi)氧化壓力上升的一種體現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間MMC藥物處理培養(yǎng)后出現(xiàn)的MTT值漸進(jìn)性的下降則與此時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞死亡相關(guān)。

2.3 Hep－2細(xì)胞中nm23的表達(dá) 喉癌細(xì)胞中nm23蛋白的表達(dá)情況：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 P＜0.01。nm23蛋白陽性表達(dá)見于細(xì)胞漿或細(xì)胞漿及細(xì)胞核，呈清晰棕黃色且明顯深于背景著色；nm23蛋白陰性表達(dá)見于細(xì)胞漿或細(xì)胞漿及核，呈清晰深藍(lán)色。

3 討論

MTT法是檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)與OD值呈線性關(guān)系，MMC抑制Hep－2細(xì)胞的生長(zhǎng)。分析時(shí)效關(guān)系時(shí)可見，隨MMC作用時(shí)間延長(zhǎng)，IR增大，引起細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢。因此，臨床上若小劑量、短期連續(xù)使用MMC可能抗癌效果更佳。這可能是nm23過表達(dá)導(dǎo)致喉癌細(xì)胞對(duì)MMC抗藥的主要原因之一。這一結(jié)論為臨床喉癌化療方案的選擇提供了理論依據(jù)。

二磷酸核苷激酶（NDPK）催化二磷酸腺苷以外的二磷酸核苷轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的三磷酸核苷，調(diào)節(jié)細(xì)胞中三磷酸核苷的含量，也調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體及細(xì)胞骨骼中微管的聚合而影響細(xì)胞分裂。當(dāng)NDPK發(fā)生改變時(shí)，由微管聚合而成的紡錘體異常，促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

nm23蛋白有與二磷酸核苷激酶（NDPK）相同的氨基酸序列和NDPK活性，因此認(rèn)為nm23抑制轉(zhuǎn)移能力可能與發(fā)揮NDPK樣功能有關(guān)。它能使GDP還原為GTP，而GTP有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜蛋白的功能，參與跨膜信息的傳遞。另外，nm23還參與微管的聚合和分解，影響細(xì)胞骨架狀態(tài)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)的狀態(tài)和阻斷腫瘤信息的傳遞而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

綜上可以認(rèn)為由于腫瘤的轉(zhuǎn)移包括多種特異性基因的激活及（或）失活，其轉(zhuǎn)移的每個(gè)步驟都可能被多個(gè)不同基因的DNA或RNA水平的變化所調(diào)節(jié)。因此，并非某個(gè)基因在任何腫瘤中都有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。顯然nm23基因是作為癌基因還是抑癌基因取決于它是否正常以及哪個(gè)信號(hào)途徑受損。如果nm23基因表達(dá)引起生長(zhǎng)抑制途徑上的G蛋白激活，它就有抑癌作用，反之則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

本文結(jié)果可見，絲裂霉素對(duì)人喉癌細(xì)胞（Hep－2 cell）有抑制作用，能夠影響到喉癌的生長(zhǎng)。

［1］鄒淑娟，梁恩虎，李思忠，等.47例喉癌綜合治理結(jié)果分析〔J〕.齊魯腫瘤雜志，1994，2：128.

［2］鄂征.組織培養(yǎng)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用〔M〕.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004：321－479.

［3］（美）D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.萊茵萬德，著.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南〔M〕.黃培堂，等譯.北京：科學(xué)出版社，2001：1379.