李 凡，張 浩，李庭玉，馬書玲

顱腦損傷(外傷、交通事故)在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中非常多見，顱腦損傷標(biāo)志著案件的發(fā)生；準(zhǔn)確推斷腦損傷時(shí)間，直接關(guān)系到案件的偵破；在臨床實(shí)踐中腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡直接關(guān)系到傷者的神經(jīng)功能喪失和傷殘程度。以往有關(guān)腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究主要關(guān)注腦缺血、缺氧性損傷和神經(jīng)細(xì)胞病變，如老年癡呆癥、帕金森癥和癲癇等[1-2]。對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡動(dòng)物試驗(yàn)研究很有限，對(duì)人腦損傷的研究報(bào)道更少[3]。本文對(duì)不同損傷時(shí)間的人腦挫傷組織進(jìn)行TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色，探討腦挫傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和調(diào)控因子Caspase-3表達(dá)的時(shí)間和空間變化，有望探索推斷腦損傷時(shí)間的新方法。

1 材料與方法

1.1材料36例人腦挫傷組織蠟塊選自死于顱腦損傷的檢驗(yàn)案例，死者性別不限，年齡18～60歲，既往健康，死亡原因?yàn)閲?yán)重顱腦損傷，大體檢驗(yàn)?zāi)X挫傷明顯。腦組織蠟塊均經(jīng)常規(guī)HE方法處理制備。根據(jù)損傷時(shí)間不同分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即2 h以內(nèi)組、4～6 h組、11～13 h組、23～25 h組、48 h及以上組，每組6例；對(duì)照組6例，為同年齡組，既往健康，因機(jī)械性損傷致心臟或大血管破裂引起急性失血短時(shí)間(1 h)內(nèi)死亡者腦組織標(biāo)本。所有腦組織標(biāo)本均在死后2～56 h通過(guò)尸體解剖取材。主要試劑：TUNEL染色試劑(美國(guó)ROCH公司產(chǎn)品)；Caspase-3 免疫組化試劑(一抗、二抗等)由武漢博士德公司提供(BA0588，SA1022)。主要儀器：奧林匹斯顯微鏡和Image-Pro Plus 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1 常規(guī)HE染色 所有腦挫傷組織標(biāo)本(約1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm)，用中性10%福爾馬林固定24～48 h，梯度酒精脫水，二甲苯置換，石蠟包埋，連續(xù)切片(5 μm)，常規(guī)HE染色、封片。

1.2.2 TUNEL染色 TUNEL染色根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法略加改進(jìn)[4]。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化置換入雙蒸水中；用蛋白酶K(20 μg/mL)消化，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗2次；滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合液(1份TdT酶—末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶，9份dUTP標(biāo)記溶液)，在濕盒內(nèi)37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次；擦干樣品周圍的水分，滴加50 μL用PBS 1∶100 稀釋的轉(zhuǎn)化劑POD，放入濕盒37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加50～100 μL DAB溶液顯色，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，蘇木素復(fù)染5 min。切片經(jīng)脫水、透明、封片。TUNEL染色的陰性對(duì)照以pH7.4，0.01 M/L PBS代替TUNEL反應(yīng)混合液。在相同試驗(yàn)條件下、同批次染色挫傷組(不同損傷時(shí)間)和對(duì)照組腦組織切片。

1.2.3 免疫組化染色 按照試劑盒中說(shuō)明書操作方法進(jìn)行，厚度為5 μm 的石蠟切片經(jīng)脫水置換入雙蒸水；用3% H2O2室溫、10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，雙蒸水洗3次；在枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)中，微波(700 W)80～90 ℃抗原修復(fù)4 min，PBS洗2次；滴加可溶性人血清白蛋白封閉非特異性抗原，室溫15 min，甩去人血清白蛋白，滴加50 μL一抗(1∶50稀釋)，在濕盒內(nèi)37 ℃ 孵育60 min，4 ℃過(guò)夜，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗3次；滴加50 μL 二抗，放入濕盒37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加SABC試劑，同樣37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB顯色5～10 min(顯微鏡下控制染色進(jìn)程)，蘇木素復(fù)染5 min，切片經(jīng)脫水、透明、封片。在相同試驗(yàn)條件下、同批次染色挫傷組(不同損傷時(shí)間)和對(duì)照組腦組織切片。Caspase-3一抗稀釋度為1∶50，Caspase-3免疫組化陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

2 結(jié)果

2.1 HE染色腦挫傷組織可見有：出血，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死，尼氏小體消失，細(xì)胞核溶解，周圍腦組織水腫明顯，局灶性蛛網(wǎng)膜下腔出血；隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞壞死明顯，小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞增多，蛛網(wǎng)膜下腔可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 TUNEL染色TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色—黃色，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。陽(yáng)性細(xì)胞核主要分布于挫傷灶的中央?yún)^(qū)和周圍的半影區(qū)，兩者有顯著差異，P<0.05，半影區(qū)比中央?yún)^(qū)更顯著；遠(yuǎn)隔部位和對(duì)照組呈陰性。并且，挫傷半影區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和染色深度隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸增加。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，挫傷半影區(qū)陽(yáng)性率和陽(yáng)性細(xì)胞IOD與損傷時(shí)間之間呈線性關(guān)系，r分別為0.89和0.93(見表1和圖1)。中央?yún)^(qū)不同損傷時(shí)間組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

表1 不同損傷時(shí)間腦挫傷組織TUNEL染色陽(yáng)性率和

① 組間比較P<0.05, ② 半影區(qū)與中央?yún)^(qū)相比P<0.05

表2 不同損傷時(shí)間腦挫傷組織Caspase-3染色的陽(yáng)性率和

① 組間比較P<0.05,② 半影區(qū)與中央?yún)^(qū)相比P<0.05

圖1 不同損傷時(shí)間人腦挫傷半影區(qū)TUNEL染色結(jié)果(TUNEL×400)

圖2 不同損傷時(shí)間人腦挫傷半影區(qū)Caspase-3免疫組化染色結(jié)果(免疫組化×400)

2.3 Caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性染色呈棕黃色，位于神經(jīng)細(xì)胞漿內(nèi)，陰性細(xì)胞為藍(lán)色。Caspase-3染色陽(yáng)性部位和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞分布相似，主要分布在挫傷灶中央及其周圍的半影區(qū)，兩者有顯著差異，P<0.05，半影區(qū)比中央?yún)^(qū)更顯著；其他部位呈陰性；表達(dá)的時(shí)序性改變與TUNEL染色基本平行。半影區(qū)陽(yáng)性率和陽(yáng)性細(xì)胞的IOD均與損傷時(shí)間之間呈線性關(guān)系，r分別為0.92和0.90(見表2和圖2)。中央?yún)^(qū)不同損傷時(shí)間組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

3 討論

腦損傷時(shí)間推斷是法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域里的研究熱點(diǎn)，許多學(xué)者試圖通過(guò)檢測(cè)顱腦損傷后病理生理過(guò)程中出現(xiàn)的某些細(xì)胞和細(xì)胞因子等指標(biāo)，研究其在腦損傷后的表達(dá)變化，探索腦損傷時(shí)間推斷的新方法。顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由許多調(diào)控基因和調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平不斷變化，引發(fā)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，在這一過(guò)程中存在時(shí)間—空間的規(guī)律性變化[5-6]。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里對(duì)顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其調(diào)節(jié)因子表達(dá)變化的觀察進(jìn)行損傷時(shí)間推斷的研究，國(guó)內(nèi)僅有少量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，尚無(wú)對(duì)人腦挫傷組織的研究報(bào)道；國(guó)外僅有少數(shù)幾位學(xué)者的研究報(bào)道。Hausmann 等在證實(shí)大鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，提出人腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目的時(shí)序性變化，可以用于法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間推斷的設(shè)想[7]。Drebler 等觀察到腦損傷時(shí)間與神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡之間有相關(guān)性，認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況可以用于腦損傷早期推斷損傷時(shí)間[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，人腦挫傷半影區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和染色深度隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸增加；TUNEL染色陽(yáng)性率和IOD均與損傷時(shí)間之間有較好的線性關(guān)系，可以用于腦挫傷損傷時(shí)間推斷。與Hausmann 和Drebler 等學(xué)者的觀點(diǎn)一致。Caspase-3是天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶Caspases超家族成員中較活躍的成員之一，參與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[9]。本研究表明，Casepase-3染色陽(yáng)性部位和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞相似，分布在腦挫傷灶的中央?yún)^(qū)及其周圍的半影區(qū)，遠(yuǎn)隔部位和對(duì)照組呈陰性。表達(dá)的時(shí)序性變化與TUNEL染色基本平行。半影區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞率和IOD有緩慢上升趨勢(shì)。

腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡已在多種創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型中得到證實(shí)，HE染色難以反映，TUNEL染色和Caspase-3免疫組化則容易區(qū)分[10]。在法醫(yī)損傷學(xué)方面，神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腦損傷后引起繼發(fā)性損害的主要原因，特別是遲發(fā)性神經(jīng)元的壞死機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的部位比壞死出現(xiàn)的部位范圍更廣。本研究也觀察到，人腦挫傷后2 h就會(huì)發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡；凋亡細(xì)胞主要分布在腦挫傷灶的中央?yún)^(qū)及其周圍的半影區(qū)，半影區(qū)比中央?yún)^(qū)更顯著，P<0.05；與遠(yuǎn)隔部位和對(duì)照組的陰性染色形成鮮明對(duì)比。與文獻(xiàn)報(bào)道的人腦外傷后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且與患者的病情嚴(yán)重程度、病程和愈后相關(guān)的結(jié)果一致[11]。因此，通過(guò)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及調(diào)控因子變化的觀察，有助于鑒別生前、死后損傷和判斷腦挫傷部位，為顱腦損傷的法醫(yī)學(xué)鑒定和研究帶來(lái)新的課題。

對(duì)比TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種染色方法的陽(yáng)性率和陽(yáng)性細(xì)胞IOD與腦損傷時(shí)間之間的線性關(guān)系基本相同。而且，檢測(cè)半影區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞率和IOD 2個(gè)參數(shù)，采用多元回歸的方法分析，更有利于提高腦損傷時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。本研究中使用的人腦挫傷組織均來(lái)源于實(shí)際檢案的案例尸檢標(biāo)本，而且TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色結(jié)合圖像分析技術(shù)，結(jié)果客觀、可靠，能夠直接應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中。但TUNEL染色操作技術(shù)難度高、試劑昂貴，影響該技術(shù)的普及和應(yīng)用。而Caspase-3免疫組化染色技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐[12]。

(致謝：感謝四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室老師們對(duì)本課題研究的指導(dǎo)和支持，在此深表感謝！)

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