燕 琳 桂伶俐 張傳漢 鄒姮婧 張玥 李大佳 石小云

異氟烷單獨或聯(lián)合咪達(dá)唑侖對7日齡大鼠大腦caspase-3表達(dá)的影響

燕 琳 桂伶俐＊張傳漢 鄒姮婧 張玥 李大佳 石小云

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉科，武漢430030）

目的 觀察異氟烷單獨或聯(lián)合咪達(dá)唑侖對7日齡大鼠大腦caspase-3表達(dá)的影響。方法 7日齡SD大鼠39只，隨機分為對照組（C組，n＝13），異氟烷組（I組，n＝13）和咪達(dá)唑侖聯(lián)合異氟烷組（MI組，n＝13）。C組：腹腔注射0.9%生理鹽水10ml／kg，吸入30%O26h；I組：在37℃恒溫并通入1.5%異氟烷的麻醉小室內(nèi)維持麻醉6h；MI組：腹腔注射咪達(dá)唑侖9mg／kg后，隨即置于37℃恒溫并通入1.5%異氟烷的麻醉小室內(nèi)維持麻醉6h。麻醉結(jié)束即刻每組取3只大鼠，行動脈血氣分析。麻醉結(jié)束2h采用Realtime-PCR方法檢測皮質(zhì)和海馬組織Caspase-3mRNA水平的變化；并用免疫組織化學(xué)SABC法檢測大腦Active caspase-3陽性神經(jīng)細(xì)胞的分布情況，計數(shù)陽性細(xì)胞。結(jié)果 ⑴I組和MI組大鼠麻醉結(jié)束即刻動脈血氣分析結(jié)果與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。⑵Realtime-PCR結(jié)果顯示，I組與 MI組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)Caspase-3 mRNA與對照組相比表達(dá)增多，且MI組與I組比較Caspase-3mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。⑶免疫組化結(jié)果也顯示：與對照組相比，I組與MI組大鼠在皮質(zhì)、海馬及丘腦部位Active caspase-3陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均明顯增多 （P＜0.05），而 MI組與I組相比，在海馬和丘腦部位Active caspase-3陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05）。結(jié)論 異氟烷麻醉能誘導(dǎo)腦發(fā)育高峰期大鼠重要腦區(qū)Caspase-3表達(dá)增加，聯(lián)合應(yīng)用咪達(dá)唑侖增加更明顯；推測Caspase-3表達(dá)增加可能引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加。

異氟烷；咪達(dá)唑侖；細(xì)胞凋亡；caspase-3

在哺乳動物腦發(fā)育高峰期，也稱為突觸發(fā)生期，易受到各種干擾因素的影響。N-甲基-D-天（門）冬氨酸（NMDA）和γ-氨基丁酸（GABA）是CNS兩大重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與形成神經(jīng)細(xì)胞的化學(xué)微環(huán)境，在CNS發(fā)育和穩(wěn)定中起著重要作用。目前臨床上常用的全麻藥包括具有NMDA受體拮抗活性（氯胺酮、N2O及氙氣）和GABAA受體激動活性（巴比妥類，咪達(dá)唑侖，丙泊酚等）及兩者兼具的藥物（吸入麻醉藥異氟烷、七氟烷等），通過調(diào)節(jié)配體門控離子通道改變突觸功能，發(fā)揮麻醉效應(yīng)［1］。突觸發(fā)生期在人類出生前3個月到出生后2至3年，即妊娠晚期至嬰幼兒時期；而在哺乳動物如大鼠主要是出生前1、2天至出生后2周［2］，其中7日齡（P7）被認(rèn)為是大鼠腦發(fā)育最高峰期。在此時期使用該類藥物對突觸發(fā)生期大腦發(fā)育是否存在毒性作用逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。因此，本研究將臨床常用麻醉藥異氟烷和咪達(dá)唑侖作用于P7大鼠，擬觀察異氟烷單獨或聯(lián)合咪達(dá)唑侖對其大腦caspase-3表達(dá)的影響，探討異氟烷與咪達(dá)唑侖致發(fā)育期大鼠的神經(jīng)毒性作用，為進(jìn)一步探討全身麻醉藥對新生兒及嬰幼兒腦發(fā)育的影響提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

1.1 實驗動物

7日齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不拘，體重13.5-16g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)中心。

1.2 主要儀器與試劑

Penlon Prima SP麻醉機（英國）、i-STAT 血氣分析儀（美國）、低溫恒冷凍切片機（Leica CM 1900，德國）和生物顯微鏡（NIKON TE2000，日本）、Imageproplus 6.0圖像分析軟件、實時定量PCR試劑盒（Takara公司，日本）、8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）和LightCycler實時熒光定量PCR儀（Roche公司，美國）；異氟烷（批號876115U，上海雅培制藥有限公司）、咪達(dá)唑侖注射液（批號20110209宜昌人福藥業(yè)）、多克隆兔抗 Active caspase-3抗體（3015-100，Biovision公司，美國），免疫組化SABC試劑盒由武漢博士德公司提供。

2.方法

2.1 分組及麻醉

分別將39只7日齡新生大鼠隨機分為3組（n＝13）：對照組（C組）：腹腔注射0.9%生理鹽水10ml／kg；異氟烷組（I組）：1.5%異氟烷麻醉6h；咪達(dá)唑侖聯(lián)合異氟烷組（MI組）：腹腔注射咪達(dá)唑侖9mg／kg后1.5%異氟烷維持麻醉6h。參照Lunardi N 等人［2］的麻醉方法并作改進(jìn)，使用 Penlon Prima SP麻醉機，連接氧源，在麻醉機輸出口接一導(dǎo)管與麻醉小室的進(jìn)氣口相連，麻醉小室的出口處連一細(xì)管與外界通風(fēng)處相通，形成麻醉管路。自制密封麻醉小室置于37℃恒溫箱，麻醉小室為長方形，大小為10cm×8cm×8cm。將I組及MI組新生鼠置于自制密封麻醉小室內(nèi)，持續(xù)給予攜帶1.5%異氟烷濃度的含30%氧氣的混合氣體（混合氣體預(yù)充麻醉管路15min）。預(yù)實驗證實混合后氣體經(jīng)氣相色譜儀檢測其攜帶異氟烷濃度與揮發(fā)罐刻度一致。C組通入僅含30%氧氣的混合氣體；氣體流量為2L／min。

2.2 血氣分析

麻醉過程中均仔細(xì)觀察新生鼠皮膚黏膜顏色變化，有無缺氧、CO2潴留等表現(xiàn)。實驗中每隔30min檢測新生鼠麻醉深度，采用針刺、尾鉗等方法，每次檢測時間不超過15s。麻醉結(jié)束后各組分別取3只新生鼠，抽取左心室血行血氣分析。其余新生鼠返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。

2.3 Real-time PCR檢測caspase-3mRNA 水平變化

麻醉結(jié)束后2h用Trizol試劑盒提取各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)的總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，按照實時定量RT-PCR試劑盒說明書取500ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以SYBRⅠ作為熒光標(biāo)記物，在ABI實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。在同一反應(yīng)體系內(nèi)對caspase-3 （NM-012922）和 內(nèi) 參 β-actin （NM-031144）mRNA進(jìn)行擴增。PCR引物為：caspase-3上游引物5’-GCAGCAGCCTCAAATTGTTGACTA-3’，下 游 引 物 為 5’-TGCTCCGGCTCAAACCATC-3’，PCR產(chǎn)物片段為147bp。β-actin上游引物 為 5’-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3’，下游引物為5’-TAGAGCCACCAATCCACACA-3’，PCR產(chǎn)物片段為104bp。擴增分三步：95℃預(yù)變性10s，95℃變性8s，60℃退火及延伸30s。設(shè)置反應(yīng)40個循環(huán)，分析融解曲線。以△Ct表示caspase-3的表達(dá)，△Ct＝ Ct（caspase-3）一 Ct（β-actin），△Ct值越高，caspase-3的表達(dá)越低。

2.4 免疫組化檢測 Active caspase-3的表達(dá)

大鼠麻醉結(jié)束后2h，10%水合氯醛300mg／g腹腔注射麻醉，快速開胸，暴露肝臟，用一次性頭皮靜脈針經(jīng)左心室插管至升主動脈，先用0.9%生理鹽水快速灌注，待右心耳流出液變成淡紅色，肝臟顏色發(fā)白時改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定20min后完整取腦，在上述多聚甲醛液中4℃后固定4-12h后，轉(zhuǎn)入30%蔗糖液中4℃過夜至下沉，從視交叉處連續(xù)做冠狀位冰凍切片，片厚15um。每只動物取2張切片，行Active caspase-3的免疫組織化學(xué)染色。具體操作步驟如下：4%多聚甲醛室溫固定15min，0.01MPBS漂洗5min，3次。0.3%TritonX-100破膜30min，0.01MPBS漂洗5min，3次。10%山羊血清封閉液室溫孵育40min，傾去勿洗，加入兔抗 Active caspase-3（1：20），放于濕盒內(nèi)4℃孵育24h。之后按照SABC試劑盒說明完成后續(xù)操作。加入適量新鮮配制DAB顯色液，鏡下觀察控制顯色時間。待出現(xiàn)紅棕色染色后立即終止反應(yīng)。之后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，照相。對每張切片隨機選取海馬、皮質(zhì)、丘腦的10個高倍視野（×400）應(yīng)用Image-Pro plus 6.0軟件計算神經(jīng)細(xì)胞染色細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)表示 Active caspase-3的表達(dá)。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間差異采用單因素方差分析﹙P＜0.05﹚。

結(jié) 果

⒈ 血氣分析

在整個實驗過程中，所有新生鼠呼吸平穩(wěn)，I組與MI組新生鼠皮膚黏膜與C組新生鼠相同，均呈粉紅色。實驗中輕微刺激I和MI組新生鼠無反應(yīng)，較重刺激有縮爪反應(yīng)。麻醉結(jié)束后即刻新生鼠左心室血氣分析顯示無明顯的缺氧、CO2潴留等現(xiàn)象發(fā)生（見表1）。

表1 麻醉結(jié)束后即刻各組新生鼠pH值、PaCO2、PaO2、HCO3-、BE和SaO2的比較（n＝5，（xˉ±s）Table 1The comparsion of pH，PaCO2、PaO2、HCO3-、BE和SaO2 among the three groups at the end of the anesthesia

⒉ 實時熒光定量PCR

在皮質(zhì)和海馬區(qū)，與C組相比，I組和MI組麻醉后2小時Caspase-3mRNA表達(dá)均顯著性增高（P＜0.05）；與I組相比，MI組麻醉后2小時caspase-3mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）（圖1-A，B）。從融解曲線圖也可看出沒有出現(xiàn)雜峰。表面實驗中未出現(xiàn)污染，引物二聚體或非特異性擴增。（圖2-A-B）

⒊ 組織學(xué)觀察

光鏡下觀察DAB顯色，胞漿內(nèi)棕黃色染色為Active caspase-3陽性細(xì)胞。C組僅有少量 Active caspase-3陽性神經(jīng)細(xì)胞。與C組相比，I組和M組在皮質(zhì)、海馬、丘腦部位 Active caspase-3陽性細(xì)胞均明顯增高（P＜0.05），與I組相比MI組在海馬和丘腦部位Active caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)增高（P＜0.05），但是在皮質(zhì)部位兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以各組海馬區(qū)Active caspase-3陽性細(xì)胞為例（圖2；×400）。各組細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（見表2）。

表2 各組Active caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)值比較（n＝5，ˉx±s）

討 論

由于世界范圍內(nèi)無痛分娩、胎兒手術(shù)，尤其是新生兒、嬰幼兒手術(shù)的廣泛開展，全憑吸入或靜吸復(fù)合麻醉方式由于起效快、可控性好等優(yōu)點逐步成為嬰幼兒臨床麻醉的主要方式。異氟烷作為鹵族吸入麻醉藥的代表，起效快、對呼吸循環(huán)影響輕微、可控性好的優(yōu)點使其在臨床麻醉包括婦產(chǎn)科和小兒麻醉中應(yīng)用廣泛；由于小兒的生理特點，咪達(dá)唑侖由于起效快、抗焦慮等作用也經(jīng)常復(fù)合用于嬰幼兒術(shù)前用藥。有研究顯示［3］咪達(dá)唑侖可以通過苯二氮類受體與GABAA受體及氯離子通道等結(jié)合成GABAA-苯二氮類受體-氯通道復(fù)合物，調(diào)節(jié)GABAA的突觸前抑制作用，從而使中樞接受的興奮性遞質(zhì)進(jìn)一步減少，增強了異氟烷的中樞抑制效果。據(jù)文獻(xiàn)報道［4］咪達(dá)唑侖大鼠常用鎮(zhèn)靜劑量為腹腔注射1-10mg／kg，大鼠的異氟烷 MAC是1.46%［5］，故我們采用的咪達(dá)唑侖9mg／kg、異氟烷1.5%相當(dāng)于臨床麻醉或亞麻醉水平。有研究發(fā)現(xiàn)出生7d的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與人類足月兒出生后0-6月發(fā)育相似［2，6］，故選擇7日齡大鼠作為研究對象可以較好模擬臨床上常用全麻藥及常用給藥模式對腦發(fā)育高峰期嬰幼兒及新生兒大腦發(fā)育的情況。

隨著對凋亡生化改變的認(rèn)識加深以及對凋亡相關(guān)基因及凋亡途徑的進(jìn)一步探索，現(xiàn)在普遍認(rèn)為Caspase家族與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，具有特異性酶切天冬氨酸氨基的位點。其中Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡的Caspase級聯(lián)反應(yīng)的最終反應(yīng)子，在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置，活化的Caspase-3蛋白被認(rèn)為是啟動凋亡程序的執(zhí)行者［7］。因此本研究選擇Caspase-3作為研究指標(biāo)，既可以從基因和蛋白水平確定凋亡的存在，也可以明確凋亡的神經(jīng)細(xì)胞的分布情況。

研究采用熒光實時定量PCR方法發(fā)現(xiàn)，暴露于異氟烷6h的P7大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)caspase-3mRNA表達(dá)升高，而暴露于異氟烷聯(lián)合咪達(dá)唑侖下，P7大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)caspase-3mRNA表達(dá)升高更明顯；免疫組織化學(xué)法也發(fā)現(xiàn)，雖然各組P7大鼠大腦在皮質(zhì)、海馬、丘腦等處有 Active caspase-3表達(dá)，但暴露于異氟烷或異氟烷聯(lián)合咪達(dá)唑侖后，在皮質(zhì)、海馬、丘腦等處的Active caspase-3表達(dá)明顯增強，其中在海馬、丘腦部位異氟烷聯(lián)合咪達(dá)唑侖比單純異氟烷導(dǎo)致的Active caspase-3的表達(dá)更明顯。這些結(jié)果也與其他學(xué)者［8-10］的研究相符。推測可能有以下原因：① 異氟烷同時具有NMDA受體拮抗活性和GABAA受體激動活性，拮抗NMDA受體降低了細(xì)胞外谷氨酸的濃度，減少了突觸形成和細(xì)胞間的連接而抑制神經(jīng)細(xì)胞；過度激活GABAA受體則導(dǎo)致中樞抑制作用更強［11］；② 咪達(dá)唑侖是是苯二氮卓類藥物且具有GABAA受體結(jié)合位點，與異氟烷合用進(jìn)一步增強中樞抑制作用［3］。另外，相關(guān)研究［12］也發(fā)現(xiàn)異氟烷可以增強突觸發(fā)生期神經(jīng)細(xì)胞的鈣振蕩，使其軸突生長速度變緩，分支數(shù)目及軸突分支總長度減少。推測其可能影響海馬神經(jīng)元之間突觸環(huán)路的形成或促進(jìn)突觸發(fā)生期神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡所致。而且有研究［13］發(fā)現(xiàn)氯胺酮（一種NMDA受體拮抗劑）觸發(fā)突觸發(fā)生期神經(jīng)細(xì)胞凋亡早期伴隨著細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）、周期性依賴蛋白激酶4（cdk4）、Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡介導(dǎo)因子（Bim）上調(diào)，細(xì)胞色素C上調(diào)以及caspase-9酶激活，之后發(fā)生的下游底物如caspase-3的激活引起的凋亡反應(yīng)；而敲除cyclinD1基因后，明顯減少Bim及活化caspase-3蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡；提示氯胺酮可能通過異常進(jìn)入細(xì)胞周期誘使細(xì)胞凋亡。異氟烷也具有NMDA受體拮抗活性，是否同樣會引起異常進(jìn)入細(xì)胞周期而導(dǎo)致凋亡還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，異氟烷單獨或聯(lián)合咪達(dá)唑侖能誘導(dǎo)突觸發(fā)生期大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦caspase-3表達(dá)增加，提示神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能增加，而由于種屬特異性，在人類發(fā)育期使用臨床濃度的異氟烷，咪達(dá)唑侖是否會導(dǎo)致同樣的損害呢？目前學(xué)術(shù)界仍有爭論［14，15］。但動物實驗結(jié)果對臨床用藥仍有一定的啟示作用，還有待進(jìn)一步實驗。

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Effect of Isoflurane，Individually or Combined with Midazolam，on the Expression of Caspase-3in Neural Cells of 7-day-old Rats

Yan Lin，Gui Lingli＊，Zhang Chuanhan，Zou Hengjing，Zhang Yue，Li Dajia，Shi Xiaoyun
（Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

ObjectiveTo investigate the effect of isoflurane，individully or combined with midazolam on the expression of Caspase-3in neural cells of 7-day-old rats.MethodsThirty-nine 7-day-old male and female SD rats were randomly divided into 3groups（n＝13each）.Control group（C）：receiving intraperitoneal injection of 0.9%saline for 6hof mock anesthesia；isoflurane group （I）：receiving 1.5%isoflurane exposure for 6hof anesthesia；midazolam isoflurane group（MI）：receiving injection of 9mg／kg midazolam immediately before 1.5%isoflurane exposure for 6hanesthesia.At the end of anesthesia，3rats of each group were taken to collect 100μl artetial blood from the left cardiac ventricle to measure the values of pH，PaO2，PaCO2，BE，HCO3-and SaO2.2hours after the end of anesthesia，the expression of caspase-3mRNA of the cortex and hippocampal were detected by real--time PCR；and the expression of active caspase-3was detected by immunohistochemistry.Results⑴ The values of pH，PaO2，PaCO2，BE，HCO3-and SaO2of I all groups shared no significant difference at the end of anesthesia.⑵ The expression of caspase-3mRNA was up-regulated in I and MI groups in cortical and hippocampal areas（P＜0.05）.⑶ Compared with those of the C group，the active caspase-3positive cells were significantly increased in the I group and the MI group in the cortical，hippocampal and thalami areas（P＜0.05）.The number of cleaved caspase-3 postive cells was significantly increased in MI group as compared with that in I group in hippocampal and thalami areas，except for the cortical area.（P＜0.05）.ConclusionExposure to isoflurane can elevate the expression of Caspase-3in 7-day-old rat brain，and its combination with midazolam can trigger even higher erpression of Caspase-3.

Isoflurane；Midazolam；Cell Apotosis；Caspase-3

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.001

2011-09-10

2011-12-01

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（200804871046）；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院院基金

燕琳，女（1984年），漢族，碩士研究生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）