馬 娟 陳吉麗 許 峰 張鴻青

昆明市第一人民醫(yī)院，云南昆明 650011

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，從基因水平闡明冠心?。╟oronary heart disease，CHD）尤其是早發(fā)CHD發(fā)病機(jī)制成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。早發(fā)CHD是冠心病的一種特殊形式，指冠心病發(fā)生時(shí)男性≤55歲，女性≤65歲[2]。國外人群研究顯示內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）及亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenete trahydro folate reductase，MTHFR）的基因變異可能參與CHD的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步探討這兩種基因多態(tài)性與早發(fā)CHD發(fā)病的相關(guān)性，筆者應(yīng)用先進(jìn)的基因芯片技術(shù)進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 對象與方法

1.1 對象

收集2007年1月～2009年12月在我院住院和門診就診的患者，根據(jù)缺血性心臟病（IHD）的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)入選CHD患者，入選人群之間無血緣關(guān)系。均行冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈病變，至少一支主要血管狹窄程度≥50%。共完成基因芯片檢測24例，其中女4例，男20例，平均年齡（49.60±6.23）歲，以男≤55歲及女≤65歲患冠心病為早發(fā)冠心病組；對照組入選65例，其中女22例，男43例，平均年齡（69.16±7.79）歲，以男＞55歲及女＞65歲患冠心病為遲發(fā)冠心病組。對兩組的一般情況進(jìn)行比較，早發(fā)CHD組年齡顯著低于對照組（P=0），三酰甘油顯著高于對照組（P=0.003），性別比列、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、左室舒張末徑、左室收縮末徑、左室射血分?jǐn)?shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 基因多態(tài)性檢測

用上海百傲生物技術(shù)有限公司提供的基因芯片，可同時(shí)檢測eNOS298、MTHFR667兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.2.1 標(biāo)本采集 用一次性無菌注射針頭采集被檢者靜脈血0.5 mL，將血樣放入含50μL的2% EDTA溶液的無菌1.5 mL離心管中，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次使混勻。

1.2.2 模板DNA的提取 取全血200μL加入紅細(xì)胞裂解液600μL，混勻，靜置8 min；6 000 r/min離心，棄上清；加入紅細(xì)胞裂解液100μL，混勻，2 500 r/min離心，棄上清；加入裂解液100μL，混勻，沸水浴中15 min，10 000 r/min離心10 min后取上清備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 YN擴(kuò)增液21μL，Taq酶0.8μL，模板DNA 3μL。

表1 兩組一般情況比較（±s）

表1 兩組一般情況比較（±s）

組別 年齡（歲）男/女（例）平均總膽固醇（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）低密度脂蛋白（mmol/L）三酰甘油（mmol/L）平均左室舒張末徑（mm）平均左室收縮末徑（mm）左室射血分?jǐn)?shù)（%）早發(fā)冠心病組遲發(fā)冠心病組P值49.60±6.23 69.16±7.79 0 20/4 43/22 0.096 5.21±1.35 4.70±1.23 0.117 1.06±0.17 1.13±0.34 0.392 3.26±1.34 2.80±1.02 0.106 2.74±1.68 1.78±1.05 0.003 52.42±10.7 51.50±7.56 0.682 37.16±13.66 35.86±9.12 0.640 59.11±16.48 56.11±13.61 0.444

1.2.4 PCR擴(kuò)增參數(shù) 預(yù)變性94℃5 min，變性94℃25 s，退火56℃25S，延伸72℃25S，熱循環(huán)數(shù)40，后延伸72℃5 min。

1.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，溴乙啶（BE）染色，Gel Doc 2000 TM凝膠成像分析儀分析判斷結(jié)果。

1.2.6 預(yù)雜交 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.5～5.0μL，加入預(yù)雜交液55μL，98℃熱變性5 min后置入冰盒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 雜交 ①在基因芯片雜交艙中加入雜交液220μL，于45℃靜置5 min，棄去雜交液。②加160μL雜交緩沖液于預(yù)雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，混勻，再加入到雜交艙中。③將基因芯片放入45℃恒溫箱中，保溫30 min。④取出基因芯片，棄去雜交艙中溶液。⑤在雜交艙中加入預(yù)熱的洗液①，45℃保溫5 min，棄去，重復(fù)此步驟兩次。

1.2.8 顯色 在雜交艙中加入洗液②220μL，室溫放置2 min；棄去雜交艙中液體，再加入標(biāo)記抗體220μL，室溫放置20 min；棄去雜交艙中液體，加入洗液②220μL，室溫放置2 min，重復(fù)此步驟一次；加入洗液③220μL，室溫放置1 min，棄去雜交艙中液體，加入顯色液220μL，45℃避光放置30 min。

1.2.9 檢測 棄去雜交艙中液體，揭除雜交艙，用蒸餾水沖洗芯片顯色區(qū)，置45℃烘干后在生物芯片識讀儀中識讀，用Array Doctor 2.0軟件進(jìn)行圖像掃描和分析，輸出檢測結(jié)果。

1.3 質(zhì)量控制

在上述操作過程中，用上海百傲生物技術(shù)有限公司提供的eNOS298基因芯片檢測為eNOS298TT型控制品為陽性參考品，eNOS298EE型為陰性參考品。MTHFR667基因芯片檢測為MTHFR667TT型控制品為陽性參考品，MTHFR667CC型為陰性參考品。隨同實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算eNOS298、MTHFR667位點(diǎn)的基因型和等位基因的人群分布頻率。樣本的代表性用基因型多態(tài)性頻率的Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早發(fā)和遲發(fā)CHD組一般情況比較

早發(fā)和遲發(fā)CHD組一般情況比較顯示，兩組年齡、三酰甘油水平差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 兩組eNOS Glu298Asp多態(tài)性檢測

早發(fā)CHD組及遲發(fā)CHD組基因型頻率適合度檢測顯示皆達(dá)到Hardy werberg平衡。早發(fā)CHD組及遲發(fā)CHD組eNOS298基因型均以EE型最常見，ED型次之，早發(fā)CHD組無DD基因型出現(xiàn)，兩組基因型分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.821），早發(fā)CHD組D等位基因頻率與遲發(fā)CHD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8.33% vs 10.77%，P=0.821）。提示eNOS298基因多態(tài)性與冠心病的早發(fā)可能無相關(guān)性。見表2。

表2 eNOS Glu298Asp基因型分布及等位基因頻率分布

2.3 兩組MTHFR667基因多態(tài)性檢測

早發(fā)CHD組及遲發(fā)CHD組基因型頻率適合度檢測顯示皆達(dá)到Hardy werberg平衡。兩組MTHFR667基因型均以CC型最常見，早發(fā)CHD組未見TT基因型出現(xiàn)，遲發(fā)CHD組未見CC型及TT基因型出現(xiàn)；兩組基因型分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.098）；早發(fā)CHD組T等位基因頻率與遲發(fā)CHD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（47.92% vs 50.00%，P=0.805）。提示MTHFR667基因多態(tài)性與冠心病的早發(fā)可能無相關(guān)性。見表3。

表3 MTHFR667基因型分布及等位基因頻率分布

2.4 eNOS298DD與MTHFR667TT基因型聯(lián)合情況

兩組病例中均未發(fā)現(xiàn)eNOS298DD與MTHFR667TT基因型聯(lián)合出現(xiàn)。

3 討論

目前，國內(nèi)外對eNOS基因多態(tài)性與冠心病之間的關(guān)系研究較多，但各個(gè)研究結(jié)果報(bào)道不一。部分研究[3-4]發(fā)現(xiàn)eNOS等位基因4a是冠心病的發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并且eNOS基因第7外顯子第78位堿基即編碼序列第894位堿基發(fā)生G突變?yōu)門與冠心病及急性心肌梗死的發(fā)生顯著相關(guān)。但也有研究顯示[5-6]，eNOS基因多態(tài)性與冠心病無顯著性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，eNOS Glu298Asp基因型在CHD組及對照組均以EE型最多見，DE型次之；兩組比較，eNOS Glu298Asp基因型分布及D等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Glu 298Asp基因變異與冠心病的發(fā)病可能無相關(guān)性，D等位基因不是冠心病的遺傳標(biāo)記。

流行病學(xué)調(diào)查研究表明，血漿同型半胱氨酸（HCY）水平升高與動(dòng)脈粥祥硬化性血管疾病危險(xiǎn)增加有關(guān)，且兩者之間存在著一種強(qiáng)烈的劑量依賴關(guān)系，HCY被認(rèn)為是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。MTHFR是HCY再甲基化途徑中的關(guān)鍵酶，該酶基因C677T是在HCY代謝途徑中最為常見的突變。目前，MTHFR基因C677T多態(tài)性與CHD的關(guān)系尚存在很大分歧。歐洲、日本等研究者[7-8]發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T突變與冠心病發(fā)病及冠狀動(dòng)脈病變程度有密切關(guān)系。而Zheng等[9]及Rothenbacher等[10]研究結(jié)果則顯示，MTHFR基因C677T突變與CHD無顯著性相關(guān)。本研究顯示MTHFR667的變異基因型和T等位基因頻率在早發(fā)冠心病組與遲發(fā)冠心病組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MTHFR667基因多態(tài)性與冠心病的早發(fā)無相關(guān)性。

早發(fā)冠心病的發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)，很多研究也提示多種基因變異促使冠心病早發(fā)，但針對不同基因分析所得結(jié)論并不完全一致，其原因是否與人選樣本地域局限，標(biāo)準(zhǔn)不一及研究技術(shù)等因素有關(guān)，而且冠心病的基因多態(tài)性不僅與種族有關(guān)，還與不同的國家、同一國家的不同地區(qū)的人群有關(guān)。因此，早發(fā)冠心病與基因多態(tài)性的相關(guān)性還需在大量的研究及臨床實(shí)踐中進(jìn)一步探索。

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