精子抗原肽的合成及其在酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗精子抗體中的應用價值

白 玲 謝 琦 佘尚揚 夏紅衛(wèi) 劉永明，*

1.桂林醫(yī)學院(541004);2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

·技術與方法·

精子抗原肽的合成及其在酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗精子抗體中的應用價值

白 玲1謝 琦1佘尚揚2夏紅衛(wèi)2劉永明1，*

1.桂林醫(yī)學院(541004);2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

目的:以合成精子抗原肽為抗原建立酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測抗精子抗體(AsAb)。方法:通過PS3全自動合成儀合成精子肽P10G、YLPl2和SP17抗原肽，經反相高效液相色譜(HPLC)純化和質譜鑒定，分別包板制備ELISA試劑盒，并檢測血清標本。結果:成功合成3種目的肽，質譜分析結果主峰分子量與理論值基本一致，HPLC結果顯示其純度為97.5%、97.78%和95.5%。以3種合成肽為抗原建立ELISA檢測AsAb，與商品化試劑盒比較，均顯示極好的一致性(Kappa值＞0.75)。結論:全自動固相多肽合成技術可用于高純度的精子抗原肽合成，所合成的P10G、YLPl2和SP17抗原肽均具有較好的抗原活性，可作為ELISA的包被抗原用于AsAb檢測。

精子抗原肽 抗精子抗體 固相多肽合成 酶聯(lián)免疫吸附測定法

不孕不育原因很多，其中2% ～10%與免疫因素有關［1，2］，9% ～36%的不孕癥夫婦存在抗精子抗體(AsAb)［3］。目前，血清中AsAb陽性已被列為人類免疫性不孕的確定指標之一。建立一種特異性強、靈敏度高、重復性好的AsAb 檢測方法對臨床免疫性不孕癥的診斷和治療至關重要。現(xiàn)常用的As-Ab檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。研究表明，合成肽能夠保持其生物活性及高度專一性的免疫原性［4］，故而研究應用人工合成肽作為抗原制備試劑盒檢測抗體受到人們重視［5］。P10G(序列為PGGGTLPPSG)來自一個14kDa的兔精子自身抗原，O'Rand等［6］研究表明來自輸精管結扎術的男性和不孕婦女的血清可與合成肽P10G發(fā)生免疫反應。YLP12(序列為YLPVGGLRRIGG)則是一段位于人類精子細胞頂體區(qū)域的肽序列，具有睪丸特異性，與人類精子和透明帶的識別和結合有關［7］。精子蛋白17(SP17)是一種哺乳動物睪丸、精子特異性抗原，主要功能是參與精子的頂體反應，促進受精過程［8，9］。對天然人 SP17 的模擬表位研究發(fā)現(xiàn):人SP17有兩個免疫優(yōu)勢的線性B細胞表位(4～19aa和118 ～127aa)［10］。本文選擇 118 ～127aa十肽序列(AVKIQAAFRG)作為SP17抗原肽進行人工合成。筆者曾手工化學合成了P10G，并成功建立檢測AsAb的ELISA方法，具有較好的應用前景［11］。在此基礎上，本文利用全自動固相多肽合成儀合成P10G、YLP12和SP17抗原肽，分別作為ELISA包被抗原檢測免疫性不孕患者血清AsAb，探討人工合成精子抗原肽作為包被抗原應用于ELISA檢測AsAb的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1肽合成主要試劑Rink amide－AM Resin、13種 Fmoc－氨基酸、哌啶、苯并三氮唑 － N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)均購自吉爾生化(上海)有限公司;N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、N－甲基嗎啉(NMM)、三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、苯甲醚購自比利時的ACROS公司;二巰基乙烷購自美國Sigma公司;乙腈購自Fisher Chemicals公司;乙醚、甲醇為國產分析純。

1.1.2血清標本由廣西婦幼保健院檢驗科提供。

1.1.3 ELISA試劑酶標板為美國Corning Costar 96孔板，包被液為0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液;封閉液為 0.01mol/L、pH7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)，內含20%滅活新生牛血清;樣品稀釋液為含20%滅活新生牛血清，0.05%Tween－20的PBS;洗滌液為含0.05%Tween－20的PBS。酶標抗體為辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自華美轉導科技有限公司。

1.2 主要儀器

PS3全自動固相多肽合成儀(Protein Technologies公司)，冷凍干燥機(Labconco公司)，多功能高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，SPD－M20A型高效液相色譜儀(大連依利特有限公司)，酶標儀(美國BioRad公司)。

1.3 方法

1.3.1精子抗原肽的固相合成、純化及鑒定在PS3全自動固相多肽合成儀上，以N－α－Fmoc保護的氨基酸為原料，Rink氨基樹脂為載體，HBTU為肽鍵縮合劑，采用固相多肽合成技術，從C端到N端按己知序列依次偶聯(lián)合成(圖1)。合成結束，取下反應瓶，在通風櫥中用DMF將反應瓶中的肽－樹脂全部沖到Poly－Prep層析柱中，用甲醇沖洗樹脂除去DMF。氮氣吹干后，加入裂解液于室溫下振蕩反應2h;反應結束用離心管收集反應液，氮氣小心吹去反應液中的TFA至反應液余2ml左右。加入－20℃無水乙醚沉淀30min;離心收集沉淀;最后用氮氣吹去乙醚，即得合成肽粗品。合成肽粗品經高效液相反相層析柱C18分離純化，收集主峰冷凍干燥后，得到反相高效液相色譜(RP－HPLC)純化的合成肽。對純化后的合成肽進行電噴霧質譜(ESI－MS)鑒定，將質譜分析的荷質比與預測的理論分子量進行比較。再經RP－HPLC分析合成肽純度。

圖1 Fmoc固相多肽合成過程

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制備用包被緩沖液將精子抗原肽作系列稀釋，分別以1、5、10、20μg/ml的濃度包被酶標板，經棋盤方陣滴定法選擇包被抗原的工作濃度。將精子抗原肽稀釋至最適包被濃度，酶標板每孔加入100μl，置4℃48h。洗滌3次。拍干后每孔加封閉液350μl，置4℃24h，洗滌5次。室溫干燥后封袋4℃保存。每孔加入100μl預先用樣品稀釋液稀釋100倍的血清標本，置37℃水浴恒溫箱保溫1h，洗滌5次后甩干。每孔加入100μl工作濃度的酶標抗體(羊抗人IgG－HRP)，置37℃水浴恒溫箱保溫1 h，洗滌5次后甩干。每孔加入100μl TMB底物溶液，置 37℃水浴恒溫箱保溫15min。最后每孔加入1mol/L H2SO450μl終止反應，在酶標儀上(波長450nm)測定每孔的吸光度。臨界值為陰性對照平均值的2.1倍。

1.3.3血清標本的檢測用上述方法自制的ELISA試劑盒檢測血清標本，與南京欣迪生物藥業(yè)工程公司生產的抗精子抗體(IgG)ELISA檢測試劑盒的測定結果進行對比。分別測定AsAb陽性血清40例，陰性血清50例。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用Kappa系數(shù)作為兩種檢驗方法一致性的檢驗指標。

2 結果

2.1 精子抗原肽的純度分析和質譜鑒定

純化后的精子抗原肽P10G、YLP12和SP17通過RP－HPLC分析，經積分計算各主峰面積，純度分別為 97.5%、97.78% 和 95.5%(圖 2)，提示均為高度純化的合成肽，可以滿足ELISA實驗作為包被抗原的需要。ESI－MS法對純化后的P10G、YLP12和SP17抗原肽凍干品進行分子量鑒定。ESI－MS分析顯示分子量分別為 836.99，1 255.69和1 060.60，與三者理論分子量(分別為 837.80、1 256.45和1 060.27)均相吻合(圖3)，證明純化后的合成產物為目的精子抗原肽。

2.2 ELISA試劑盒包被檢測條件

以合成的P10G、YLP12和SP17抗原肽分別作為包被抗原制備 ELISA試劑盒，檢測血清 AsAb(IgG)，經棋盤方陣滴定法確定各抗原肽的最適包被濃度為5mg/L。

2.3 血清標本檢測對照實驗

以南京欣迪生物藥業(yè)工程公司生產的AsAb(IgG)ELISA試劑盒的檢測結果作為標準對照，測定結果及統(tǒng)計處理結果見表1。

P10G包被檢測特異性為100%，靈敏度為77.5%，兩種檢驗方法符合率為90%，Kappa值為0.79;YLP12包被檢測特異性為100%，靈敏度為75%，兩種檢驗方法符合率為89%，Kappa值為0.77;SP17抗原肽包被檢測特異性100%，靈敏度為85%，兩種檢驗方法符合率為93.3%，Kappa值為0.87。

表1 包被試劑盒與商品試劑盒測定結果的比較

3 討論

檢測AsAb是診斷免疫性不育癥及觀察其治療效果的常用方法，目前用于AsAb檢測的ELISA試劑盒通常是利用有正常生育能力者的精子直接提取抗原，或者普通合成肽抗原包被酶標板，但其抗原來源受到限制，且穩(wěn)定性和重復性不理想;或者由于合成肽肽段比較短小，在包被過程中容易造成表位無法完全呈現(xiàn)，而影響檢出率，導致假陰性。于是一種易得、穩(wěn)定的精子抗原成為需要［12，13］。人工合成多肽抗原相比其他抗原成分明確，有較高的敏感性和特異性，而且制備簡單、快速，生產中不存在生物安全問題，還可以去除傳統(tǒng)抗原的毒性片段，提高抗原肽的安全性;或進一步重組免疫增強序列以提高抗原性。人工合成肽作為ELISA試劑盒的包被抗原，因其分子量小、結構簡單、純度高而無其它蛋白成分，明顯提高檢出的特異性和敏感性而受到青睞，并且因其抗原成分明確，適于檢測試劑盒的標準化。

本文采用Fmoc法固相多肽自動合成技術，成功合成了P10G、YLP12和SP17特異性精子抗原肽，經高效液相純化分析，純度高達97.5%、97.78%和95.5%;純化后的精子抗原肽經ESI－MS分析，證明合成并純化所得的物質為目的精子肽。用所合成精子肽P10G、YLP12和SP17抗原肽分別包被酶標板，建立ELISA試劑盒檢測已知AsAb陽性、陰性血清標本，與商品化的AaAb ELISA檢測試劑盒檢測結果比較，總符合率均大于或接近90%。Kappa值為0.79、0.77 和0.85，表明這兩種方法的檢驗結果具有極好的一致性。這說明所合成的3個肽段均有較好的抗原活性，可以以此為基礎進一步探索優(yōu)化檢測AaAb的ELISA試劑盒。

由于合成肽片段較短，且肽段的空間結構與天然蛋白的空間結構有可能不完全一致，多表現(xiàn)為線性表位，故對檢測的結果可能有一定的影響。如采用多個抗原肽混合包被而可以同時包含多個抗原表位，或進一步與重組蛋白混合包被，可能會提高檢出率。本研究對以合成多肽為抗原的AaAb檢測ELISA法做了初步探討，對AsAb檢測方法的改進和包被用抗原的標準化有重要意義，可以進一步篩選出更高敏感性抗原肽段或肽段組合作為檢測用抗原，以提高檢測的敏感性，滿足臨床檢驗需求。

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Synthesis of sperm antigen peptides and its application in detection of antisperm－antibodies

Bai Ling1，Xie Qi1，She Shangyang2，Xia Hongwei2，Liu Yongming1，*
1.Guilin Medical University，Guilin541004;2.Maternal and Child Health Hospital of GuangxiCorresponding author:Liu Yongming，E－mail:liuym@glmc.edu.cn

Objective:To synthesize sperm peptides for establishment of the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)to detect antisperm－antibodies(AsAb).Methods:The sperm peptide P10G，YLPl2 and SP17 were synthesized by the PS3 automated solid phase peptide synthesizer，purified by RP－HPLC and identified by mass spectrum(MS).With the synthetic peptide as a coating antigen，the ELISA method was used to detect serum concentration of AsAb.Results:The molecular weights of three synthesize peptides identified by MS were in good agreement with calculated molecular weights.The purity of the synthetic peptides purified by HPLC was 97.5%，97.78%and 95.5%.AsAb was detected by the indirect ELISA based on the peptide compared with the commercial kit，and results showed that both assays were unanimous with Kappa value more than 0.75.Conclusion:Automated solid －phase peptide synthesis could be used to synthesize high purity sperm antigen peptides.The synthesized peptide P10G，YLPl2 and SP17 show high antigenic activities and can be used as a coating antigen for indirect ELISA to detect AsAb.

Sperm antigen peptide;Antisperm－antibody;Solid－phase peptide synthesis;Enzyme－linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.08

廣西壯族自治區(qū)科技廳科學研究與技術開發(fā)項目(桂科攻0632007－1I)

2011－11－04

2012－01－28

*通訊作者:liuym@glmc.edu.cn

［責任編輯:張 璐］