汪敬業(yè)羅本燕汪凱

·綜 述·

非凋亡性的程序性死亡在神經(jīng)疾病中的作用☆

汪敬業(yè)*羅本燕△汪凱*

神經(jīng)元 程序性死亡 程序性壞死 自噬凋亡

細(xì)胞死亡方式分為程序性死亡（programmed cell death，PCD）和非程序性死亡，目前已經(jīng)闡明的程序性死亡方式有凋亡、自噬性死亡和程序性壞死等3種類型[1]。由于認(rèn)識的局限，相當(dāng)長時間內(nèi)凋亡（apoptosis）和PCD基本等同，而壞死被歸為非程序性死亡，因此既往PCD研究主要集中在凋亡上。近年發(fā)現(xiàn)了兩種非凋亡性的PCD：自噬性死亡（autophagic cell death）和程序性壞死（programmed necrosis或necroptosis），研究發(fā)現(xiàn)這兩種PCD在神經(jīng)元死亡中同樣扮演重要角色，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，其機(jī)制的闡明將有助于探尋到更多治療神經(jīng)疾病的有效措施。本文結(jié)合國內(nèi)外研究成果及我們前期的研究對神經(jīng)元程序性死亡方式及其相互關(guān)系加以綜述，并闡述某些評價細(xì)胞死亡方式的方法學(xué)缺陷，以加深對神經(jīng)元死亡機(jī)制的了解，減少對實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋的偏倚，從而便于指導(dǎo)基礎(chǔ)和臨床研究。

1 凋亡

已有不少綜述闡述凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，本文主要簡述凋亡檢測方法學(xué)及其缺陷。細(xì)胞死亡方式的識別包括形態(tài)學(xué)改變、信號分子以及特異性標(biāo)記物的出現(xiàn)，其中形態(tài)學(xué)改變以及特異性標(biāo)記物是判斷細(xì)胞死亡類型的主要依據(jù)，電鏡下的形態(tài)學(xué)改變是金標(biāo)準(zhǔn)。以下幾個條件常作為凋亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①具備凋亡的形態(tài)學(xué)特征；②原位末端標(biāo)記法（Terminal deoxynucleotidyl transfer?ase dUTP nick end labeling，TUNEL染色）陽性；③電泳時呈現(xiàn)“DNA梯帶”；④凋亡分子標(biāo)記物出現(xiàn)。既往不少文獻(xiàn)僅檢測其中一個指標(biāo)即判定為細(xì)胞凋亡，其中TUNEL染色陽性和“DNA梯帶”使用尤其多[2]。但越來越多的研究表明TUNEL染色并不能很好地區(qū)別細(xì)胞凋亡與非細(xì)胞凋亡，在壞死和自溶性死亡中也會出現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞[2-3]。細(xì)胞凋亡時DNA不僅可裂解成180～200 bp片斷，也可裂解為300 bp～50 kbp的片斷，甚至不出現(xiàn)“DNA梯帶”；相反，在壞死的早期同樣可出現(xiàn)“DNA梯帶”，說明“DNA梯帶”也非細(xì)胞凋亡的特異性判定標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。電鏡下見到凋亡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是判定凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)，但某些切面的電鏡照片可出現(xiàn)核內(nèi)假包涵體（核膜內(nèi)陷）或染色質(zhì)外突，這些結(jié)構(gòu)容易被誤認(rèn)為凋亡[3]。大鼠全腦缺血模型研究中發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)死亡神經(jīng)元TUNEL染色陽性，但未見凋亡標(biāo)記物caspase-3的激活，電鏡下也未觀察到經(jīng)典的凋亡結(jié)構(gòu)[4]，這些結(jié)果進(jìn)一步說明腦缺血損傷時TUNEL染色陽性并不代表神經(jīng)元發(fā)生凋亡。

2 自噬

適度的自噬能實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的再利用，有助于維持細(xì)胞的功能和存活，然而自噬的過度發(fā)生也可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腦缺血缺氧、癲癇、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)感染等疾病研究中電鏡下可觀察到自噬泡及自噬溶酶體的形成，分子生物學(xué)方面能檢測到自噬標(biāo)記物L(fēng)C3、Atg、Beclin 1等基因或蛋白的表達(dá)增加。采用自噬阻斷劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）、Wortman?nin或Bafliomycin A1（BFA）以及敲除Atg、Beclin 1等自噬相關(guān)基因后能夠減少神經(jīng)元死亡，改善小鼠的行為學(xué)，這些結(jié)果表明自噬廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展[5-7]。雖然上述疾病神經(jīng)元死亡過程中伴隨有自噬的形成，但自噬在神經(jīng)系統(tǒng)變性病的神經(jīng)元死亡中的確切作用尚不確切，適度的自噬可能有助于神經(jīng)元的存活，而自噬過度才導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[5-7]。腦缺血后自噬的激活是誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡還是促進(jìn)神經(jīng)元存活尚未取得一致的結(jié)論，有結(jié)果表明自噬在其中發(fā)揮保護(hù)作用[5-6,8]。我們在全腦缺血誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元死亡研究中電鏡下檢測到自噬結(jié)構(gòu)的形成，LC3-II表達(dá)增加，說明自噬有激活，采用自噬阻斷劑3-MA能減輕神經(jīng)元死亡，但電鏡下神經(jīng)元死亡形態(tài)學(xué)符合程序性壞死。迄今，自噬性死亡的研究中仍缺乏如凋亡中的凋亡小體那樣的形態(tài)學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)，觀察到自噬結(jié)構(gòu)只能說明有自噬發(fā)生，但并不代表細(xì)胞一定為自噬性死亡，上述我們腦缺血后神經(jīng)元死亡的研究結(jié)果也支持這一結(jié)論。研究表明常用的自噬阻斷劑3-MA除抑制溶酶體酶釋放外還能抑制細(xì)胞色素C的釋放、caspase-3的激活以及溶酶體酶cathepsin B的釋放，這些結(jié)果表明自噬阻斷劑除抑制自噬外尚有其他的保護(hù)機(jī)制，提示不能僅根據(jù)自噬阻斷劑有保護(hù)作用即完全判定細(xì)胞為自噬性死亡[4,9]。此外，我們對結(jié)果的解釋時也需注意到不同的自噬抑制劑分別作用于自噬的不同階段，如自噬的起始階段（3-MA，Wortmannin），自噬泡和溶酶體融合階段（BFA），以及溶酶體內(nèi)的降解階段。

3 壞死與程序性壞死

3.1 壞死 細(xì)胞壞死通常為一種病理性死亡，既往認(rèn)為壞死是一個被動的死亡過程，其形態(tài)學(xué)特征是：細(xì)胞及細(xì)胞器腫脹，線粒體空泡變性，溶酶體破壞伴溶酶體酶外泄，核濃縮、核碎裂及核溶解等改變，細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞質(zhì)外溢，壞死的細(xì)胞成分在鄰近組織中引起炎癥反應(yīng)。局灶性腦缺血梗死中心區(qū)、腦缺血缺氧、中毒、腦死亡等急性損傷性疾病中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)快速死亡，形態(tài)學(xué)上符合壞死特征。

3.2 程序性壞死 近期，越來越多的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些類型的壞死同樣可受到諸多因素的精確調(diào)控，表現(xiàn)為程序性死亡過程，稱為程序性壞死[10-11]。程序性壞死的死亡形態(tài)學(xué)特征類似壞死，即有細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞核的腫脹、破壞等形態(tài)學(xué)改變；但卻是死亡受體、受體相互作用蛋白（recep?tor-interacting protein，RIP）中RIP1和RIP3、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）[12]、線粒體磷酸酶PGAM5（phosphoglycerate mutase family member 5）[13]、NAD依賴的去乙?；窼IRT2（sirtuin 2）[14]等信號分子參與調(diào)控的程序性死亡過程，其中RIP3是細(xì)胞凋亡與壞死相互轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)[10,12-17]。目前闡明的程序性壞死信號通路大致分為如下3個階段：第一階段包括TNF受體、嘌呤受體、NMDA受體激活以及DNA損傷；第二階段是鈣超載、神經(jīng)酰胺、ROS產(chǎn)生、ATP消耗、聚ADP核糖聚合酶激活、脂質(zhì)過氧化等細(xì)胞代謝以及線粒體、溶酶體通透性增加等細(xì)胞器改變；最后階段是蛋白酶的激活，使質(zhì)膜通透性增加、核裂解，出現(xiàn)壞死的形態(tài)學(xué)改變[18-19]。

目前發(fā)現(xiàn)的程序性壞死特異性的抑制劑有necro?statin-1（nec-1）和necrosulfonamide（NSA），Nec-1通過抑制RIP1激酶活性從而抑制RIP3磷酸化[11,15,20]，而NSA通過特異識別MLKL從而阻止壞死信號的傳導(dǎo)[12]。研究表明Nec-1可以減小局灶性腦缺血梗死面積、新生小鼠缺血缺氧性神經(jīng)元死亡、減輕NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損害[11,21-22]。此外，癲癇、神經(jīng)退行性疾病、病毒感染等疾病過程中均可見到程序性壞死的參與[19,23]。我們研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠全腦缺血誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，TUNEL染色陽性，電鏡下可見自噬的激活，細(xì)胞器水腫、斷裂，細(xì)胞膜、核膜消失、核裂解、溶酶體酶cathepsin B釋放等細(xì)胞壞死特征，上述特點(diǎn)符合程序性壞死，說明全腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡實(shí)際為程序性壞死[4]。既往部分研究根據(jù)TU?NEL染色陽性、DNA梯帶或蛋白質(zhì)合成抑制劑能減輕其死亡等結(jié)果認(rèn)為全腦缺血后神經(jīng)元死亡方式為凋亡，也有部分研究根據(jù)形態(tài)學(xué)改變判定為壞死[24]，程序性壞死的發(fā)現(xiàn)很好的統(tǒng)一了這兩種矛盾性的研究結(jié)論。

10.3936/j.issn.1002-0152.2013.09.013

☆ 國家自然科學(xué)基金（編號：81100877，81271272）；教育部博士點(diǎn)基金—新教師類基金（編號：20113420120003）

*安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(合肥230022)

（E-mail：wangkai1964@126.com）

△浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腦研究中心、神經(jīng)內(nèi)科