邢慧芳，李煥敏，王英杰，張旭慧，焦麗琴，李素婷

(1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2010級(jí)，河北承德 067000;2.指導(dǎo)教師)

學(xué)生園地

乙醛刺激大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6增殖的體外研究

邢慧芳1，李煥敏1，王英杰1，張旭慧1，焦麗琴1，李素婷2

(1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2010級(jí)，河北承德 067000;2.指導(dǎo)教師)

乙醛;肝星狀細(xì)胞;增殖;模型

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖與酒精性肝纖維化的形成密切相關(guān)，是酒精性肝損傷發(fā)展至肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[1]。乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛是刺激HSC活化增殖，導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子[2]。本研究以乙醛作為刺激物，觀察乙醛刺激大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的最佳濃度和最佳時(shí)間，為后期酒精性肝纖維化的的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，凱基生物有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基，GIBCO公司;胎牛血清，Hyclone公司;MTT，Sigma公司;DMSO，上海生工。CO2培養(yǎng)箱，日本Taibai LNA-122D;倒置顯微鏡，德國(guó)Olympus;酶標(biāo)儀，日本BIO-RAD;離心機(jī)，上海TGL.16G。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng):大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞換液時(shí)間為1-2d，傳代時(shí)間為2-3d，傳代前用0.25%的胰酶消化。

1.2.2 細(xì)胞分組:細(xì)胞傳代穩(wěn)定后，HSC隨機(jī)分為空白對(duì)照組和乙醛不同濃度刺激組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。乙醛刺激組給予乙醛刺激，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)不同濃度乙醛對(duì)HSC增殖的影響:調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×105后，均勻接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔總體積為200μl，各組細(xì)胞培養(yǎng)至70%-80%融合時(shí)，0.4%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理細(xì)胞12h后，更換為完全培養(yǎng)基。乙醛刺激組給予不同濃度乙醛刺激，乙醛濃度分別為17.5μmol/L、87.5μmol/L、175μmol/L、350μmol/L、875μmol/L、1750μmol/L、2650μmol/L、3500μmol/L，刺激時(shí)間為24h，每12h補(bǔ)加乙醛一次;空白對(duì)照組加等體積培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)24h后，加入5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸棄孔內(nèi)上清液，各孔加入二甲基亞楓200μl，低速震蕩10min，以溶解被還原的MTT結(jié)晶，用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)（測(cè)定波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm）檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算不同濃度下乙醛刺激HSC增殖率與存活率。

增值率=[(乙醛組A值/對(duì)照組A值)－1]×100%

存活率=(乙醛組A值/對(duì)照組A值)×100%

1.2.4 MTT法觀察不同刺激時(shí)間乙醛對(duì)HSC增殖的影響:細(xì)胞計(jì)數(shù)、接種于96孔板中培養(yǎng)同上。乙醛刺激組選擇最佳濃度350μmol/L，分別刺激12h、24h和36h，每12h補(bǔ)加一次乙醛，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)基。各孔加5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸棄孔內(nèi)上清液，各孔加入二甲基亞楓200μl，低速震蕩10min，以溶解被還原的MTT結(jié)晶，酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)(測(cè)定波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm）檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算乙醛刺激不同時(shí)間點(diǎn)的HSC增殖活性。

2 結(jié)果

2.1 MTT法觀察不同濃度乙醛對(duì)HSC增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，乙醛在17.5μmol/L至2650μmol/L濃度梯度下刺激HSC，均有較好的增殖率，和對(duì)照組比較，差異有顯著意義(P＜0.01)，細(xì)胞存活率在100%以上，且以350μmol/L刺激增殖效果最好。但乙醛濃度增至875μmol/L以上時(shí)，細(xì)胞殖值率開(kāi)始下降，且存活率低于100%;當(dāng)乙醛濃度增至3500μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)負(fù)值，提示隨著乙醛刺激濃度的增加，乙醛對(duì)HSC產(chǎn)生毒性反應(yīng)。因此，選擇增殖率和存活率均大于100%的濃度(350μmol/L)作為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度乙醛對(duì)HSC增殖及存活率的影響

2.2 MTT法檢測(cè)乙醛刺激不同時(shí)間對(duì)HSC增殖的影響 選擇乙醛刺激HSC增殖的最佳濃度，各組大鼠HSC培養(yǎng)12h、24h和36h，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞增殖基本一致，乙醛組在加入乙醛后，細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增加，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)增殖明顯提高，和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。乙醛刺激24h細(xì)胞增殖活性達(dá)高峰。表明350μmol/L刺激24h是大鼠HSC增殖的最佳濃度和最佳時(shí)間。見(jiàn)表2。

表2 乙醛刺激HSC增殖不同時(shí)間點(diǎn)的MTT測(cè)定結(jié)果[MTT法(A值)]

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過(guò)程，而酒精性肝損傷是造成肝纖維化的主要病因之一。肝星狀細(xì)胞活化、增殖在酒精性肝纖維化形成中起關(guān)鍵作用。研究表明，乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛可刺激肝星狀細(xì)胞增殖，是導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素[3]。本研究選擇乙醛作為致病因子進(jìn)行體外研究，通過(guò)MTT法觀察乙醛刺激大鼠HSC增殖的最佳濃度和最佳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)乙醛刺激HSC增殖呈現(xiàn)先增后減的量效關(guān)系，350μmol/L乙醛刺激HSC的增殖率和存活率均達(dá)到最佳狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，選擇350μmol/L乙醛作為刺激濃度作用于大鼠HSC，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，HSC增殖亦呈現(xiàn)先增后減的時(shí)效關(guān)系，且24h是乙醛刺激細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間。因此，選擇350μmol/L乙醛刺激24h可以成為比較理想的體外酒精性肝纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停蔀楹罄m(xù)探討酒精性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及防治作用的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]趙箐.酒精性肝纖維化中肝星狀細(xì)胞活化的機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2006,33(3):198-203.

[2]陳川寧，陶忠樺，李紅.乙醛對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6激活、增殖及轉(zhuǎn)分化的影響[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,34(3): 217-220.

[3]蔣明德，甘新宇，解方為，等.乙醛對(duì)大鼠HSC增殖及膠原基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2002,12(2): 97-100.

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1004-6879(2013)05-0438-02

2013-04-28)