劉愛旗　夏璐

【摘要】 目的：探討CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細胞活性的最佳實驗條件，并比較其優(yōu)略。方法：以傳至第3代的兔成纖維細胞為研究對象，分別用CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細胞的增殖活性。結果：MTT法的最佳檢測波長490 nm，CCK-8法最佳檢測波長為450 nm，兩法的最佳檢測時間均為加入試劑后4 h。適宜檢測的細胞數(shù)量范圍為2×103/ml ～1×105 /ml 個。結論：CCK-8法較MTT法檢測的靈敏度高，準確性好，是一種優(yōu)于MTT法的檢測兔成纖維細胞增殖活性的方法。

【關鍵詞】 CCK-8； MTT； 兔成纖維細胞； 細胞增殖

檢測細胞增殖活性的方法很多，如3H放射性同位素摻入法、細胞儀法、臺盼藍染色法、MTT法等。其中以MTT法以其快速而簡便、不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用，但MTT法形成的Formazan為水不溶性的[1]，加有機溶劑溶解，由于在去上清液時可能會丟失小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了避免Formazan的部分丟失，研究人員又開發(fā)了很多水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等[2]，本文對CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細胞增殖活性的最佳實驗條件進行探討，并比較其優(yōu)略。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 以兔筋膜作為成纖維細胞原代培養(yǎng)組織，培養(yǎng)、傳代并培養(yǎng)傳至第3代，以第3代的成纖維細胞為研究對象[3]。

1.2 材料與儀器 胎牛血清、胰酶、DMEM、雙抗、PBS液。60 mm培養(yǎng)皿、倒置相差顯微鏡、離心機、96孔板、酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 最佳檢測波長和最佳測定時間 取以對數(shù)生長期的第3代兔成纖維細胞，以0.25%胰酶消化、計數(shù)、接種于接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl的細胞懸液，濃度為1×104個/ml，重復種植5個孔，在空白對照孔加入培養(yǎng)基100 μl，在96孔板的四周加PBS液100 μl，以保持96孔板的濕度。連續(xù)接種6個96孔板，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁。CCK-8組每孔加入10 μl CCK-8試劑，在37 ℃恒溫箱中分別繼續(xù)孵育1、2、3、4、5、6 h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組的OD值，檢測5個孔的OD值，并取其平均值；檢測MTT組時吸去上清液，并在每孔加入100 μl含MTT試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h，檢測前先吸出孔內液體，每孔加入150 μl的DMSO液，振蕩使其溶解，分別檢測其不同波長下的OD值[4]。

1.3.2 細胞數(shù)量與吸光度的關系 取對數(shù)期生長第3代兔成纖維細胞，以0.25%胰酶消化、計數(shù)、接種于接種于96孔培養(yǎng)板，每個孔細胞濃度從高到低依次為4×104個/ml、

2×104個/ml、1×104個/ml、5×103個/ml、2.5×103個/ml、1.25×103個/ml、7.5×102個/ml、4×102個/ml、2×102個/ml，每個濃度種5孔，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后，分別加入CCK-8試劑和MTT試劑，在酶標儀上測量其OD值。

2 結果

2.1 最佳檢測波長的確定 如圖1所示，用CCK-8法檢測兔成纖維細胞活性時，在450 nm處的吸光峰值最高，CCK-8法檢測時的最佳波長為450 nm。由圖2可知，MTT法檢測時的最佳波長為490 nm。

2.2 最佳測定時間的確定 從圖1、圖2可見，在加入MTT試劑和CCK-8試劑后，孵育1～6 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀分別檢測1～6 h的OD值，孵育1～4 h，OD值呈上升趨勢，4～6 h OD值出現(xiàn)下降的趨勢，孵育4 h時檢測OD值最大，靈敏度最高。因此用MTT法和CCK-8法檢測兔筋膜成纖維細胞的活性時，應該在加入MTT試劑和CCK-8試劑孵育后的4 h檢測最佳[5]。

2.3 細胞數(shù)量與吸光度的關系 用兩種方法檢測細胞數(shù)量與吸光度的關系如圖3所示。從圖3可見，隨著細胞濃度的增加，兩種方法測得的OD值都增大，在103處OD值開始增加較明顯，104處OD值接近峰值，隨著濃度增加，OD值增加的不明顯。

3 討論

MTT法的優(yōu)點：簡單、方便、快速、無放射性污染、應用范圍廣。缺點：MTT法的中間代謝產物為不溶于水的結晶物，在加入有機溶劑前需要棄上清液，會造成一定的誤差。而CCK-8法的中間代謝產物為可溶性的，且不需要棄上清液，操作相對較為簡便[6]。

從圖3可以看出，CCK-8法測得的OD值始終大于MTT法測得的OD值，另CCK-8法比MTT法對細胞濃度變化更敏感，測得的結果更為準確。本實驗還探討了MTT法和CCK-8法在測定兔成纖維細胞的最佳實驗條件，MTT法的最佳檢測波長490 nm，CCK-8法最佳檢測波長為450 nm，兩法的最佳檢測時間均為加入試劑后4 h。適宜的細胞數(shù)量范圍2×103～1×105個。

綜上所述，CCK-8法較MTT法檢測的靈敏度高，準確性好，是一種優(yōu)于MTT法的檢測兔成纖維細胞增殖活性的方法。

參考文獻

[1] Tominaga H，Ishiyama M，Ohseto F，et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J].Anal Commun，1999，36（1）：47-50.

[2] Rassendren F，Buell G，Newbolt A，et al.Identification of amino acidresidues contributing to the pore of a P2X receptor[J].The EMBO Journal，1997，16（2）：3446.

[3] 朱曉弘.兔結膜成纖維細胞的體外培養(yǎng)[J].國際眼科雜志，2005，5（2）：253-255.

[4] 侯春梅，李新穎，葉偉亮，等.MTT法和CCK-8檢測懸浮細胞增殖的比較[J].軍事醫(yī)學科學院刊，2009，8（4）：400-401.

[5] 熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較[J].激光生物學報，2007，10（5）：559-560.

[6] 辛陪成，楊圣.CCK-8法檢測兔筋膜成纖維細胞增殖活性之最佳測試條件研究[J]. 中外醫(yī)學研究，2011，9（4）：6-8.

（收稿日期：2012-11-23） （本文編輯：陳丹云）