劉相真，孔俊豪，趙粼，許金偉，楊秀芳*

（1.浙江省茶葉集團(tuán)茶葉研究所有限公司，浙江杭州 310016；2.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；3.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018）

頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定茶多酚類制品中有機(jī)溶劑殘留量

劉相真1，孔俊豪2，趙粼3，許金偉3，楊秀芳2*

（1.浙江省茶葉集團(tuán)茶葉研究所有限公司，浙江杭州 310016；2.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；3.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018）

建立茶多酚制品中13種有機(jī)溶劑殘留的頂空氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)80℃、15m in靜態(tài)頂空后，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表明，13種有機(jī)溶劑平均回收率為69.39%～99.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。方法的檢出限為0.0004～0.339μg/m L。該方法一次進(jìn)樣可同時(shí)分離和測(cè)定茶多酚制品中13種有機(jī)溶劑，準(zhǔn)確靈敏，簡(jiǎn)單快速，適用于茶多酚制品有機(jī)溶劑殘留的測(cè)定。

頂空，氣相色譜質(zhì)譜法，茶多酚，有機(jī)溶劑殘留

茶多酚是茶葉中多酚類化合物的總稱，占茶葉干物質(zhì)的12%～25%，是茶葉中最重要的生物活性成分之一，是良好的天然抗氧化劑，具有抗癌、抗衰老、抗輻射、消除人體自由基、降血糖脂、防治心血管病、抑菌抑酶、沉淀金屬等功能[1]。目前，茶多酚產(chǎn)品主要用于醫(yī)藥、食品和化工等行業(yè)。

茶多酚制備一般包含提取、過(guò)濾、濃縮、萃取、純化、干燥等工藝過(guò)程[2]。在整個(gè)制備過(guò)程中，廣泛使用有機(jī)溶劑，其殘留影響到茶多酚制品在藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用的安全性。從各國(guó)藥典歷版的修訂內(nèi)容來(lái)看，需控制殘留量的有機(jī)溶劑種類越來(lái)越多，而且對(duì)于殘留溶劑的控制種類和殘留量的可接受限度也與ICH中的要求達(dá)到了統(tǒng)一。因此，有必要對(duì)茶多酚制品中有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量安全，從而指導(dǎo)生產(chǎn)工藝的改進(jìn)[3]。

本試驗(yàn)參考《中國(guó)藥典》有關(guān)殘留溶劑測(cè)定法[4]，采用靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)茶多酚類制品中乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲苯、二甲苯等13種殘留溶劑進(jìn)行分析研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀和Agilent MSD ChemStation；頂空進(jìn)樣器（DK-5001A）北京中興分析儀器研究所及頂空瓶（20mL）；旋渦混合器(ABSON,Minplus)；N,N-二甲基乙酰胺（DMAC, Product of TEDIA）；蒸餾水、氯化鈉（分析純）。

正已烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、苯、乙腈、三氯甲烷、甲苯、乙苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯等13種溶劑購(gòu)于天津市化學(xué)試劑研究所(純度≥99.8%)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取正已烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、苯、乙腈、三氯甲烷、甲苯、乙苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯各504.9mg、514.0mg、476.4mg、488.6mg、1233.2mg、504.7mg、489.2mg、991.1mg、504.0mg、84.0mg、69.2mg、296.5mg、44.5mg置于已加入少量N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）的50mL容量瓶中，待溶解完全后，用N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）定容至刻度。對(duì)應(yīng)的濃度為10.098mg/mL、10.280mg/ mL、9.530mg/mL、9.772mg/mL、24.664mg/mL、10.094mg/mL、9.784mg/mL、19.822mg/mL、10.080mg/mL、1.680mg/mL、1.384mg/mL、5.930mg/ mL、0.890mg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（1∶20000）的配制：將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，經(jīng)用水進(jìn)行逐級(jí)稀釋至20000倍。

吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用水進(jìn)行逐級(jí)稀釋至所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3 測(cè)定條件

1.3.1 頂空條件

平衡溫度：80℃(見(jiàn)2結(jié)果與分析)；平衡時(shí)間：15min（見(jiàn)2結(jié)果與分析）；傳輸線溫度：120℃；進(jìn)樣針溫度：120℃；進(jìn)樣量：1mL。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱：Agilent DB-FFAP石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為180℃，分流比10∶1；柱箱溫度為初始溫度30℃，保持5min，以每分鐘上升5℃，升至80℃，后運(yùn)行溫度為200℃，保持5min；色譜柱初始流速為0.5m L/min，保持4min，以10mL/min升至1mL/min，直至進(jìn)行結(jié)束；載氣He（99.999%）。

1.3.3 質(zhì)譜條件

EI電離能量為70eV，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，接口溫度為280℃，掃描方式為全掃描。

1.4 樣品前處理與測(cè)定

準(zhǔn)確稱取茶多酚制品1.00g和NaCl 0.96g，置于頂空瓶中，加入5mL的水，立即蓋上蓋子，密封，用旋渦混合器振蕩1min，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖中各溶劑的保留時(shí)間、定量離子和定性離子，確定樣品中的殘留溶劑，根據(jù)定量離子的峰面積計(jì)算樣品中各個(gè)有機(jī)溶劑的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空進(jìn)樣條件的選擇

2.1.1 平衡溫度

樣品的平衡溫度與被測(cè)組分的蒸汽壓有直接關(guān)系。準(zhǔn)確量取5mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（1∶20000）于頂空瓶中，平衡溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，平衡時(shí)間為15min，自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，得到各有機(jī)溶劑定量離子的峰面積和平衡溫度間的關(guān)系見(jiàn)圖1。

從圖1中可知，在相同的平衡時(shí)間條件下，隨著平衡溫度的升高，峰面積隨之增大，分析靈敏度也相應(yīng)提高。但太高的平衡溫度會(huì)導(dǎo)致頂空瓶氣密性變差和水蒸汽進(jìn)入色譜系統(tǒng)污染毛細(xì)管色譜柱及質(zhì)譜系統(tǒng)，影響方法精密度，所以在滿足靈敏度的前提下，盡量選擇較低的平衡溫度，本實(shí)驗(yàn)除甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈外，其它溶劑在70℃時(shí)峰面積基本達(dá)到平衡，而考慮到甲醇在70～80℃之間，峰面積增加較高，因此選擇80℃作為本實(shí)驗(yàn)的平衡溫度。

2.1.2 平衡時(shí)間

圖1 溫度對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction efficiency

平衡時(shí)間取決于被測(cè)組分分子從樣品基質(zhì)到氣相的擴(kuò)散速度，即與分子大小、介質(zhì)黏度及溫度有關(guān)。準(zhǔn)確量取5mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（1∶20000）于頂空瓶中，在80℃平衡溫度中分別采取5min、10min、15min、20min、25min等不同平衡時(shí)間，自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，得到各有機(jī)溶劑的峰面積和平衡時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖2。因此本實(shí)驗(yàn)選擇15min為平衡時(shí)間。

2.1.3 鹽析作用

圖2 平衡時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of time on extraction efficiency

在水溶液中加入無(wú)機(jī)鹽（如NaCl）來(lái)改變揮發(fā)性組分的分配系數(shù)。實(shí)驗(yàn)證明，鹽濃度小于5%時(shí)幾乎沒(méi)有作用，故常用高濃度的鹽，甚至用飽和濃度。需要指出的是，鹽析作用對(duì)極性組分的影響遠(yuǎn)大于對(duì)非極性組分的影響[5]。NaCl在平衡溫度80℃時(shí)的飽和溶解度為38.4g，因此，在已加入5m L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（1∶20000）的頂空瓶中分別加入1.92g、0.96g、0.48g、0.24g、0g NaCl，按測(cè)定條件進(jìn)行檢測(cè)，得到NaCl對(duì)萃取效率的影響見(jiàn)圖3。從圖3中可知，NaCl對(duì)極性組分甲醇、乙腈、丙酮等具有促進(jìn)作用，而對(duì)非極性組分正已烷、乙酸乙酯具有一定的抑制。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇加入0.96g NaCl。

2.1.4 定性定量條件的選擇

選擇質(zhì)荷比較大、相對(duì)豐度較大的碎片離子作為定量離子，依此原則再選擇1到2個(gè)碎片離子作為定性離子，以定量離子和定性離子共流出與否以及豐度比來(lái)判斷樣品是否含有目標(biāo)溶劑，由定量離子的峰面積來(lái)定量。13種有機(jī)溶劑的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

圖3 氯化鈉對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of NaCl on extraction efficiency

2.1.5 13種有機(jī)溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)液總離子流圖

圖4 13種有機(jī)溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)液的GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS of a m ixture of 13 organic solvent residues

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，經(jīng)用水進(jìn)行逐級(jí)稀釋至1∶100000、1∶50000、1∶20000、1∶10000、1∶5000，制成系列濃度混合對(duì)照溶液；用移液管準(zhǔn)確量取5mL各系列濃度混合對(duì)照溶液，置20mL頂空瓶中，封瓶，自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定。以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 13種有機(jī)溶劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS Parameters for 13 organic solvent residues

2.3 檢出限及測(cè)定限

將混合對(duì)照品溶液用水逐步稀釋，直到檢測(cè)峰高為基線噪音的3倍，以3倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的含量即為方法的檢出限；以10倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的含量為方法的定量限。各溶劑的檢出限見(jiàn)表2。結(jié)果表明，13種有機(jī)殘留溶劑的檢出限均遠(yuǎn)低于濃度限值見(jiàn)表4，滿足微量分析的要求。

2.4 精密度和回收率

用移液管準(zhǔn)確量取2個(gè)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL于已放置1.00g茶多酚制品和0.96gNaCl的頂空瓶中，按1.3測(cè)定條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n= 5），其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。結(jié)果表明，加標(biāo)樣品中13種有機(jī)殘留溶劑的加標(biāo)回收率范圍為69.39%～100.80%，加標(biāo)RSD均小于5%，滿足微量分析的要求。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Regression equation of standard curve,correlation coefficien t,linear range and lim it of detection(LODs)

2.5 樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)收集到48個(gè)茶多酚樣品進(jìn)行測(cè)定，所檢樣品含有13種有機(jī)殘留溶劑的一種或幾種。所測(cè)各樣品中有機(jī)殘留溶劑的最高檢出濃度及參考《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定的殘留溶劑濃度限度值[4]見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)建立的靜態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定茶多酚類制品中有機(jī)溶劑方法，樣品前處理操作簡(jiǎn)便，方法的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度滿足微量分析的要求，適用于茶多酚類制品正已烷、丙酮、苯、二氯甲烷等13種有機(jī)溶劑殘留的測(cè)定。

表3 精密度和回收率（n=5）Table 3 Recoveries and precisions(n=5)

表4 茶多酚樣品中各有機(jī)溶劑最高檢出濃度及參考限度值Table 4 The highest content for organic solvent residues detected in tea polyphenols specimens and a reference for upper lim its

[1] 楊賢強(qiáng).茶多酚保健功效研究的新進(jìn)展[J].茶葉,1992,18(3): 42-45.

[2] 江和源.茶葉功能成分提取制備專題(一)茶葉功能成分的開(kāi)發(fā)利用與提取制備[J].中國(guó)茶葉,2009,(1):8-10.

[3] 劉相真,梁慧玲,孔俊豪,等.茶多酚制品中有機(jī)溶劑多殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)茶葉加工,2012,(4):23-31.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,附錄ⅧP.

[5] 劉虎威.氣相色譜方法及應(yīng)用[M].北京:化工出版社,2007.

Determ ination of Organic SolventResidues in Tea Polyphenolsby Headspaceand Gas Chromatography-massSpectrometry

LIU Xiang-zhen1,KONG Jun-hao2,ZHAO Lin3,XU Jin-wei3,YANG Xiu-fang2*
(1.Research Institute Co.,LTD of Zhejiang Tea Group,Hangzhou 310016,China; 2.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China; 3.Zhejiang Economic and Trade Polytechnic,Hangzhou,310016,China)

A headspace and gas chromatography-mass spectrometry(HS-GC/MS)method was established for the determ ination of 13 residual organic solvent in tea polyphenols.The experimental conditions of HS-GC such as static-headspace temperature,headspace time and the analytical conditions of GC and MS were optimized.The tea polyphenols'samples were extracted and cleaned-up by headspace at 80℃for 15min,determined by gas chromatography and mass spectrometry.The 13 poisonous organic solventwere separated efficiently from impurities with high sensitivity and reproducibility.The relative standard deviations(RSDs)were less than 5%,the recoveries were from 69.39%～99.01%,the linear range was 0.0089-4.9823μg/m L with a good linear correlation coefficient(r＞0.991),and the limits of detection were 0.0004～0.339μg/mL bymean of the above developed HS-GC/MSmethod. 13 residual organic solvent in tea polyphenols were detected accurately and simultaneously in a single sample injection.The method is accurate,simple,rapid,and is suitable for the trace analysis ofmulti-mixture of residual organic solvent in tea polyphenols.

Headspace,Gas chromatography-mass spectrometry,Tea polyphenols,Organic solvent residual

TS207.3

A

2095-0306（2013）04-0040-06

2013-09-10

國(guó)家質(zhì)檢公益項(xiàng)目（201110210）

劉相真（1980-），男，浙江寧海人，主要從事茶葉理化檢驗(yàn)及研究工作。

*通訊作者：teatesting@sina.com