王烈 樂(lè)涵波 何劍營(yíng) 陳冬冬 續(xù)力云 劉曉光 張永奎 竺王玉

●診治分析

非小細(xì)胞肺癌EGFR基因第一內(nèi)含子（CA）n多態(tài)性與基因突變及預(yù)后的關(guān)系

王烈 樂(lè)涵波 何劍營(yíng) 陳冬冬 續(xù)力云 劉曉光 張永奎 竺王玉

目的 研究非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因第一內(nèi)含子（CA）n[intron 1（CA）n]多態(tài)性與EGFR基因突變的關(guān)系，并觀察患者的預(yù)后。方法觀察129例NSCLC患者生存情況，檢測(cè)患者手術(shù)切除新鮮癌組織或石蠟包埋組織EGFR基因intron 1（CA）n及19、21外顯子突變。結(jié)果129例NSCLC患者中，檢出EGFR基因突變35例（27．1%），其中EGFR19外顯子21例（16．3%），21外顯子15例（11．6%）。EGFR intron 1（CA）n出現(xiàn)頻率最多的等位基因?yàn)椋–A）20（38．8%），其次為（CA）16（26．4%）。短（CA）n與EGFR基因突變有關(guān)，特別是19外顯子突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），但與21外顯子突變無(wú)明顯相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（CA）16與19外顯子突變有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。EGFR基因intron 1短（CA）n與長(zhǎng)（CA）n NSCLC患者總生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論EGFR第一內(nèi)含子短（CA）n，特別是（CA）16重復(fù)序列可能是影響19外顯子缺失突變的一個(gè)重要因素。（CA）n多態(tài)性不是NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＞0．05）。

非小細(xì)胞肺癌 表皮生長(zhǎng)因子受體 單核苷酸多態(tài)性 基因突變

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship among epidermal growth factor receptor(EGFR)gene intron 1(CA)n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)．MethodsThe EGFR gene intron 1(CA)n polymorphisms,exons 19 and 21 mutation in fresh tissue or paraffin-embedded tissue sections were amplified with PCR,followed by direct sequencing in 129 surgically-removed specimens of NSCLC．ResultsEGFR mutations were detected in 35 of 129(27．1%)patients with NSCLC．There were 21 cases(16．3%)with mutations in exon 19 and 15 cases(11．6%)with mutations in exon 21．EGFR intron 1(CA)n was occurred more frequently in(CA)20 allele(50/129,38．8%）,followed by(CA)16 allele (34/129,26．4%)．A genetic association was found between shorter CA alleles and EGFR mutations,especially exon 19 mutations (P＜0．05),but not exon 21 mutation(P＞0．05)．(CA)16 allele conferred high capability for retaining EGFR exon19 mutation(P＜0．05)．There was no significant difference in the overall survival time between patients with EGFR intron 1 short(CA)n polymorphisms and with long(CA)n polymorphisms(P＞0．05)．ConclusionEGFR intron1 short(CA)n，especially(CA)16 polymorphisms may be involved in the accumulation of the EGFR exon 19 deletions during lung cancer development and(CA)n polymorphisms may be not associated with the prognosis of patients with NSCLC．

近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域體細(xì)胞突變的發(fā)現(xiàn)及其抑制劑的成功使用為肺癌患者治療帶來(lái)了新的希望。該突變90%為21外顯子L858R點(diǎn)突變及19外顯子缺失突變[1]。但是，在肺癌進(jìn)展過(guò)程中，如何發(fā)生EGFR突變，還未可知。目前觀察到，EGFR突變主要發(fā)生于女性及亞洲人種[2-3]，說(shuō)明EGFR突變與種系有很大關(guān)系。已有研究表明EGFR呈現(xiàn)高度多態(tài)性，而且其表達(dá)受其多態(tài)性調(diào)控，特別是EGFR基因第一內(nèi)含子（CA）n[intron 1（CA）n]與EGFR表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)[4]，但有關(guān)intron 1（CA）n與EGFR突變的關(guān)系還未見有系統(tǒng)的分析研究。本研究探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因intron 1（CA）n多態(tài)性與EGFR突變情況及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2006-06—2012-07在舟山醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的NSCLC患者未進(jìn)行放療、化療或其他抗腫瘤治療的患者351例，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法選取129例。其中男83例，女46例，年齡31～82（59.4±4.1）歲；129例患者經(jīng)手術(shù)切除的肺癌組織（新鮮組織99例，石蠟包埋組織30例）均經(jīng)切片及HE染色，由2位病理醫(yī)師診斷為NSCLC，并證實(shí)其中含有80%以上腫瘤組織。其中腺癌70例，鱗癌47例，原位腺癌12例；低分化65例，中-高分化64例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例；Ⅰ/Ⅱa期75例，Ⅱb/Ⅲ/Ⅳ期54例。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取新鮮腫瘤組織30mg，研磨棒研碎，用DNA MINI kit（德國(guó)Qiagen公司）提取DNA；石蠟包埋組織制成10μm切片，用DNA FFRPE Tissue kit（德國(guó)Qiagen公司）提取DNA，操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠鑒定，Q-3000微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Quawell Technology，Inc公司產(chǎn)品）測(cè)定DNA含量。

1.2.2 聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和測(cè)序 采用PCR方法擴(kuò)增EGFR基因第一內(nèi)含子、19外顯子及21外顯子。EGFR intron1（CA）n上游引物為5′-GGGCTCACAGC AAACTTCTC-3′，下游引物為5′-CAAGGTCTGGGAACCACTGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為405 bp；EGFR 19外顯子上游引物為5′-CCCCAGCAATATCAGCCTTA-3′，下游引物為5′-TGTG GAGATGAGCAGGGTCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為355bp；EGFR 21外顯子上游引物為5′-GAATTCGGATGCAGAGCTTC-3′，下游引物為5′-TCATTCACTGTCCCAGCAAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為441bp。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5μl，5×Q-Solution 10μl，100 mmol dNTP 0.1μl（美國(guó)ABI公司），2.5UHot-Star Taq DNA聚合酶（德國(guó)Qiagen公司），50 ng模板DNA 5μl，ddH2O補(bǔ)足體積至50μl。PCR反應(yīng)條件：95℃15min；94℃15s，60℃30s，72℃1min，10個(gè)循環(huán)；94℃15s，56℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。取5μl PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100V，30min），ChemiDoc凝膠成像儀判定擴(kuò)增片段。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序 用EasyPureTMPCR Purification Kit（北京全式金公司）純化PCR產(chǎn)物，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。測(cè)序反應(yīng)PCR：1μl BigDye，0.5ml BigDye seqBuffer，1M引物（3.2pmoL/μl），1μl純化PCR產(chǎn)物，1.5μlddH2O。96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4 min，25個(gè)循環(huán)，4℃恒溫，正反向測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)PCR產(chǎn)物用乙醇/EDTA沉淀法純化，Hi-Di Formamide溶解DNA后，95℃變性4 min，迅速置冰中冷卻4min，然后在ABI3100XL基因分析儀上樣電泳。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析 采用ABI Sequencing Analysis V5.4軟件分析原始測(cè)序結(jié)果，ABI SeqScap軟件與EGFR序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)合人工校對(duì)，判斷EGFR基因突變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)（1≤T＜5且n≥40采用校正χ2檢驗(yàn)，T＜1或n＜40采用Fisher精確概率法），均為雙側(cè)檢驗(yàn)危險(xiǎn)因素采用logistic回歸分析，生存率的比較采用kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，預(yù)后因素采用Cox分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者EGFR基因突變及長(zhǎng)短intron1（CA）n多態(tài)性與臨床病理特征的關(guān)系 在129例NSCLC患者中，檢出EGFR基因突變35例（27.1%），其中EGFR19外顯子21例（16.3%）（圖1），21外顯子15例（11.6%）（圖2），頻率最多的EGFR intron 1（CA）n等位基因?yàn)椋–A）20（50例，38.8%，圖3），其次為（CA）16（34例，26.4%，圖4）、（CA）19（11例，8.5%）、（CA）18（9例，7.0%）、（CA）21（8例，6.2%）、（CA）15（7例，5.4%）、（CA）17（7例，5.4%）、（CA）22（3例，2.3%）。根據(jù)患者EGFR intron 1（CA）n分布的中位數(shù)，將（CA）n分為短（CA）n組[（CA）n≤19）[和長(zhǎng)（CA）n組[（CA）n＞19）]。NSCLC患者EGFR基因突變及長(zhǎng)短intron 1（CA）n多態(tài)性與臨床 病理特征的關(guān)系見表1。

圖1 ERFR 19外顯子E746-A750del

圖2 EGFR 21外顯子L858突變

圖3 EGFR intron（CA）20重復(fù)多態(tài)性

圖4 EGFR intron（CA）16重復(fù)多態(tài)性）

由表1可見，NSCLC患者EGFR基因突變與性別、肺癌組織學(xué)類型、是否吸煙有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（CA）n等位基因與患者的年齡、性別、吸煙狀況、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態(tài)性與突變的關(guān)系 見表2。

表2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態(tài)性與突變的關(guān)系[例（%）]

由表2可見，NSCLC患者短（CA）n與EGFR基因突變有關(guān)，特別是19外顯子突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但與21外顯子突變無(wú)明顯相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中（CA）16與患者19外顯子突變有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而（CA）20的患者較少發(fā)生EGFR 19外顯子突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 NSCLC患者EGFR基因intron1（CA）n多態(tài)性與突變Logistic回歸分析見表3。

表3 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態(tài)性與突變Logistic回歸分析

由表3可見，將變量賦值：長(zhǎng)（CA）n=0，短（CA）n= 1；其他=0，（CA）n=1，二元條件Logistic回歸分析顯示NSCLC患者EGFR基因（CA）16是EGFR突變，特別是19外顯子突變的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。

2.4 EGFR基因intron 1（CA）n多態(tài)性與NSCLC患者總生存時(shí)間的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，自肺癌根治術(shù)后短（CA）n的NSCLC患者平均生存時(shí)間為54.65個(gè)月，短（CA）n患者平均生存時(shí)間為52.89個(gè)月，長(zhǎng)（CA）n患者平均生存時(shí)間為57.25個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。對(duì)總生存時(shí)間多因素COX回歸分析結(jié)果（表4）亦顯示，EGFR基因intron 1短（CA）n并不是NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（OR= 1.247，95%CI=0.660～2.355，P＞0.05）。

圖5 短（CA）n與長(zhǎng)（CA）n NSCLC患者總生存時(shí)間的比較

表4 NSCLC患者術(shù)后總生存時(shí)間的Cox危險(xiǎn)因素分析

3 討論

根據(jù)外顯子突變部位的不同，EGFR突變表現(xiàn)為各種不同的臨床模式，如在19外顯子上表現(xiàn)為片段缺失，在18及21外顯子上則表現(xiàn)在單核苷酸突變。有研究報(bào)道EGFR基因21外顯子突變主要發(fā)生在女性、非吸煙的腺癌患者，而19外顯子突變則與男性有關(guān)[5]。本結(jié)果顯示NSCLC患者EGFR突變與女性、非吸煙者及腺癌有關(guān)，與之前研究結(jié)果相一致[2-3]。EGFR第一內(nèi)含子（CA）n重復(fù)序列多態(tài)性在本組中國(guó)人群中的分布主要為（CA）20，其次為（CA）16，與研究報(bào)道的東亞裔人群（CA）n分布一致[6]。

EGFR基因第一內(nèi)含子中包含1個(gè)由9～23CA的短重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)可影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，與EGFR mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)镽NA延長(zhǎng)終止的位點(diǎn)位于CA重復(fù)序列附近，那里有2個(gè)主要的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，當(dāng)CA重復(fù)序列延伸時(shí)，EFGR多態(tài)性區(qū)域可以高度折疊，影響DNA螺旋，并增強(qiáng)阻遏蛋白的結(jié)合性，但其具體的確切機(jī)制尚不清楚[7]。有多項(xiàng)研究顯示NSCLC患者攜帶短CA重復(fù)序列與EGFR基因突變有關(guān)，特別是19外顯子突變，如Sueoka-Arangeane等[8]發(fā)現(xiàn)短CA重復(fù)序列與19外顯子缺失突變有關(guān)，同時(shí)攜帶短CA重復(fù)序列且發(fā)生19外顯子突變的肺腺癌患者EGFR mRNA轉(zhuǎn)錄水平要顯著高于攜帶長(zhǎng)CA重復(fù)序列的患者；Liu等[9]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者（CA）19重復(fù)是EGFR基因19外顯子突變的危險(xiǎn)因素；Nie等[10-11]發(fā)現(xiàn)CA重復(fù)次數(shù)≤16的NSCLC患者EGFR蛋白表達(dá)增加，且攜帶短CA重復(fù)序列的患者經(jīng)過(guò)吉菲替尼治療后存活明顯長(zhǎng)于攜帶長(zhǎng)CA重復(fù)序列的患者。本結(jié)果亦顯示短（CA）n與EGFR基因突變有關(guān)，特別是19外顯子缺失突變，而與21外顯子突變則無(wú)明顯關(guān)系。EGFR intron1（CA）16重復(fù)的NSCLC患者更易發(fā)生19外顯子缺失，是致EGFR突變的危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)EGFR 19外顯子缺失突變的NSCLC患者EGFR mRNA、蛋白表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生突變者[12]，由此推測(cè)（CA）n重復(fù)序列多態(tài)性可能影響EGFR19外顯子缺失突變，進(jìn)而影響其mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并改變EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性。但是，NSCLC患者EGFR intron1（CA）n重復(fù)序列多態(tài)性與總生存時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)，并不是致肺癌患者死亡的危險(xiǎn)因素，與之前研究結(jié)果相一致[13]。

可見，在NSCLC進(jìn)展過(guò)程中，EGFR第一內(nèi)含子短（CA）n，特別是（CA）16重復(fù)序列可能是影響19外顯子缺失突變的一個(gè)重要因素。有關(guān)其是否可預(yù)測(cè)EGFR酪氨酸激酶的療效還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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Relationship among epidermal growth factor receptor gene intron 1（CA）n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer

Non-small cell lung cancerEpidermal growth factor receptorSingle polymorphism Gene mutation

2012-10-04）

（本文編輯：楊麗）

浙江省科技廳資助項(xiàng)目（2011C37030）

316004舟山醫(yī)院胸心外科（王烈、樂(lè)涵波、張永奎），免疫基因組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（何劍營(yíng)、陳冬冬、續(xù)力云、劉曉光、竺王玉）

竺王玉，E-mail：zhuwangyu24@gmail.com