劉海燕, 王晨陽, 崔玉娟, 周玉文, 徐 鵬, 曹雪濱

?

心復(fù)康口服液對急性力竭大鼠心肌壞死的保護(hù)作用

劉海燕, 王晨陽, 崔玉娟, 周玉文, 徐 鵬, 曹雪濱*

（解放軍第252醫(yī)院心內(nèi)科, 全軍老年心血管病研究診療中心, 保定 071000）

觀察急性力竭應(yīng)激運動后大鼠心肌組織的壞死情況以及心復(fù)康口服液的保護(hù)作用。采用SD雄性大鼠制作急性游泳力竭模型。40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：對照組，低劑量心復(fù)康+急性力竭組，高劑量心復(fù)康+急性力竭組，急性力竭組。其中心復(fù)康+力竭組于每天9∶00～10∶00點用心復(fù)康口服液灌胃6周，對照組與急性力竭組灌胃等量生理鹽水。造模成功后即刻取材，電鏡觀察各組心肌組織變化；提取心肌組織總DNA檢測基因壞死程度；Western印跡法測定心肌組織細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）及其磷酸化蛋白（p-ERK）的表達(dá)情況。電鏡觀察顯示急性力竭大鼠心肌組織線粒體腫脹、肌節(jié)壞死明顯，且其心肌DNA降解明顯。與力竭組相比，心復(fù)康＋力竭組的心肌組織電鏡形態(tài)、DNA完整度均有明顯改善，p-ERK表達(dá)均明顯上升（＜0.05）。預(yù)服心復(fù)康口服液對心肌壞死有一定程度的預(yù)防作用。

心復(fù)康口服液; 急性力竭; 心肌壞死

力竭運動是一種超出機(jī)體負(fù)荷的應(yīng)激運動，急性力竭運動時，機(jī)體代謝速率加快，血液和氧氣的需求突然增加，而機(jī)體供給的速度相對滯后，在這種狀態(tài)下，容易造成心肌急性相對缺血，引起心功能障礙及心肌結(jié)構(gòu)損傷壞死[1?3]。運動急性猝死的案例并不少見，如何預(yù)防及是否可以通過預(yù)服心臟保護(hù)藥物來降低猝死的研究相對較少[4?6]。心復(fù)康口服液是以益氣活血為立方依據(jù)組成的方劑，主要用以治療充血性心力衰竭及各種心肌損傷，在解放軍252醫(yī)院臨床應(yīng)用多年。本文采用一次性急性力竭游泳訓(xùn)練制作大鼠急性力竭模型，觀察急性力竭應(yīng)激運動后大鼠心肌組織的壞死情況以及心復(fù)康口服液的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體質(zhì)量（200±25）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2003-1-003。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

40只大鼠隨機(jī)分為4組：對照組，低劑量心復(fù)康+急性力竭組，高劑量心復(fù)康＋急性力竭組和急性力竭組，每組10只。每天上午9∶00～10∶00點對低劑量心復(fù)康+急性力竭組以5ml/（kg·d）心復(fù)康口服液灌胃，高劑量心復(fù)康+急性力竭組以10ml/（kg·d）心復(fù)康口服液灌胃，同時急性力竭組及對照組分別給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 試劑與藥品

戊巴比妥鈉購于Sigma公司；心復(fù)康口服液為本院自制，批準(zhǔn)文號：北制字（2006）F17003；批號20110406、20110526；99%紅景天苷粉劑購于上海英軒生化試劑有限公司；GAPDH抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated kinase，ERK）與其磷酸化蛋白（phosphorylated ERK，p-ERK）抗體均購于CST公司，BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE膠等試劑購于北京莊盟試劑公司。

1.3 大鼠力竭模型的制作

采用經(jīng)典Thomas方法制備大鼠急性力竭模型。采用高70cm，直徑50cm的水桶做游泳槽，水深55cm以上，水溫（30±2）℃，每個水桶一次至多放入2只大鼠游泳。正式試驗前進(jìn)行一次尾部負(fù)重2%的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，運動前大鼠稱重，選取5%體質(zhì)量的鉛絲懸掛于大鼠尾部。游泳力竭模型建立的判定標(biāo)準(zhǔn)：游泳時間超過5h；呼吸急促，游泳運動不協(xié)調(diào)；10s不上浮；撈出后現(xiàn)神情疲倦、呆滯、無逃避反應(yīng)等疲勞癥狀。

1.4 電鏡觀察心肌組織

麻醉大鼠開胸取心，在心臟尚在搏動時，取直徑約1mm的心尖部位，立即用4℃的3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液固定，切為1mm3的小塊，放入試劑瓶中固定4h，磷酸鹽緩沖液漂洗后用4℃的1%鋨酸再固定1.5h，漂洗后乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片60nm，醋酸鈾、櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.5 Western印跡法檢測p-ERK和ERK表達(dá)量

心肌組織取全部左心室，勻漿提取蛋白。BCA法測量各組蛋白含量，將蛋白調(diào)節(jié)上樣量一致，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離。濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫孵育1h，按0.1ml/cm2的量加入一抗p-ERK或ERK抗體：1∶2000稀釋；GAPDH：1∶2000稀釋，4℃過夜后，TBST洗膜3次，每次10min。二抗室溫孵育1h。TBST清洗3次，ECL顯像，凝膠成像系統(tǒng)自動曝光，曝光成像、掃描、軟件分析。

1.6 DNA檢測心肌細(xì)胞壞死

提取心肌組織DNA，檢測核酸純度與濃度后于2%瓊脂糖凝膠電泳，80V，30min，染色后凝膠成像觀察DNA斷裂情況。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察

電鏡結(jié)果顯示，對照組可見正常心肌組織，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，肌絲清楚，肌節(jié)整齊，線粒體豐富，無水腫，無空泡；急性力竭組的肌節(jié)周基質(zhì)高度水腫，線粒體和糖原明顯減少，線粒體大部分嵴和膜融合、模糊不清或缺少；低劑量心復(fù)康口服液用藥＋急性力竭組中線粒體腫脹，部分線粒體嵴溶解，但情況較急性力竭組輕微；高劑量心復(fù)康口服液用藥＋急性力竭組中核周隙輕度擴(kuò)張，接近縱切，肌節(jié)排列整齊，核周間隙稍微變寬（圖1）。

2.2 Western印跡法檢測

各組心肌細(xì)胞ERK總蛋白量表達(dá)差異不明顯，而磷酸化蛋白 p-ERK表達(dá)有明顯變化，對照組中p-ERK基本不表達(dá)，而急性力竭組中表達(dá)量最高，心復(fù)康口服液用藥組的表達(dá)量處于中間水平，且與用藥劑量相關(guān)（圖2）。

2.3 DNA檢測

對照組和高劑量心復(fù)康口服液用藥組DNA完整無降解，力竭組DNA降解明顯，大部分?jǐn)嗔褳?000bp左右的片段，低劑量心復(fù)康口服液用藥組DNA也有降解，但與急性力竭組比較程度有所減輕（圖3）。

圖1 各組心肌組織電鏡結(jié)果

Figure 1 Transmission electron microscopy of all groups(×15 000)

A: control group; B: high dose Xinfukang oral liquid +acute exshausted exercise group; C: low dose Xinfukang oral liquid +acute exshausted exercise groups; D: acute exhaustive group

圖2 各組心肌組織Western印跡法結(jié)果

Figure 2 Western blot results of all groups

A: control groups; B: high dose Xinfukang oral liquid +acute exshaustedexercise groups; C: low dose Xinfukang oral liquid +acute exshausted exercise groups: D: acute exhaustive group

圖3 各組心肌組織DNA電泳結(jié)果

Figure 3 DNA electrophoresis results of all groups

M: marker; A: control groups; B: high dose Xinfukang oral liquid +acute exshausted exercise groups; C: low dose Xinfukang oral liquid +acute exshausted exercise groups; D: acute exhaustive group

3 討 論

力竭運動是指過度運動超過機(jī)體自身的調(diào)節(jié)能力。力竭運動會造成心臟損傷，主要表現(xiàn)在心肌損傷、心功能受損、心肌結(jié)構(gòu)改變、心臟生化改變等方面[7,8]。探討力竭運動損傷機(jī)制及從傳統(tǒng)的中醫(yī)藥角度去緩解力竭損傷有著重要意義。本實驗從力竭性運動誘發(fā)心肌損傷的角度，探討心復(fù)康口服液對力竭運動后心臟損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

我們的電鏡實驗結(jié)果顯示急性力竭能嚴(yán)重影響心臟的微觀形態(tài)，與對照組相比，即刻力竭大鼠的肌原纖維從極度收縮的有組織狀態(tài)變?yōu)榧≡w維失去方向的無組織狀態(tài)，肌節(jié)周極度水腫，線粒體表現(xiàn)為腫脹并伴有嵴的瓦解和線粒體膜之間的間隙變窄，這與以往的報道一致[9?11]。與急性力竭組比較，以心復(fù)康口服液10ml/（kg·d）灌胃6周后再力竭，心肌受損明顯減輕，說明心復(fù)康口服液可以有效預(yù)防力竭運動造成的心肌損傷。

在對急性力竭的研究中，很多報道都集中在對凋亡的研究上。我們進(jìn)行DNA檢測發(fā)現(xiàn)，實驗中的力竭大鼠DNA并未表現(xiàn)出凋亡應(yīng)出現(xiàn)的DNA ladder現(xiàn)象，而是出現(xiàn)了大面積的彌散，表明DNA發(fā)生了降解，這說明在急性力竭過程中，DNA發(fā)生了損傷。同樣，心復(fù)康口服液有效緩解了力竭運動對心肌造成的損害，這可能與心復(fù)康口服液降低心肌耗氧量及心肌攝取率有關(guān)。在心肌中絕大多數(shù)是線粒體，線粒體是對各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，在力竭過程中，心肌細(xì)胞缺血缺氧，很可能由于大量的自由基攻擊線粒體，造成線粒體DNA斷裂，最終線粒體腫脹壞死。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-絲裂原活化蛋白激酶（ERK-mitogen-activated protein kinase，ERK-MAPK）是由Boulton等在1990年初期先后分離鑒定的一種蛋白激酶，是MAPK家族中的重要成員，由一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶酸化而成[12,13]。ERK-MAPK對細(xì)胞應(yīng)激具有特異性反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活，能被大量的胞外因子激活[14]，研究ERK-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對闡明力竭心臟的病理生理機(jī)制和研究防治機(jī)制有重要意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)力竭運動能引起ERK-MAPK的磷酸化，但不影響ERK-MAPK總蛋白表達(dá)量，說明ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了機(jī)體對力竭產(chǎn)生的應(yīng)激。

力竭運動中局部組織和細(xì)胞的死亡稱為壞死，當(dāng)各部分損傷作用達(dá)到一定的強(qiáng)度和持續(xù)時間，受損的組織、細(xì)胞代謝完全停止，即可引起組織和細(xì)胞的死亡。進(jìn)一步研究力竭造成的臟器損傷及運用廣泛的中藥資源來有效地預(yù)防，對提高運動效率，減少訓(xùn)練心臟損傷有著重要意義。

[1] 王曉偉, 曹雪濱. 力竭性運動對心臟影響的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究與教育, 2012, 29(4): 60?64.

[2] 王福文, 胡志力, 李 杰. 力竭性運動致運動性心肌損傷的產(chǎn)生機(jī)制[J]. 中國臨床康復(fù), 2005, 9(8): 144?146.

[3] 李 爽, 李燕舞, 阿拉木. 力竭性運動對大鼠胃組織損傷的研究[J]. 成都體育學(xué)院學(xué)報, 2008, 34(1): 81?83.

[4] Harmon KG, Asif IM, Klossner D,. Incidence of sudden cardiac death in national collegiate athletic association athletes[J]. Circulation, 2011, 123(15): 1594?1600.

[5] 董玉福. 學(xué)生運動性猝死頻發(fā)的原因及預(yù)防對策探析[J]. 大理學(xué)院學(xué)報, 2013, 12(3): 26?30.

[6] Estes NA 3rd, Link MS. Preparticipation athletic screening including an electrocardiogram: an unproven strategy for prevention of sudden cardiac death in the athlete[J]. Prog Cardiovasc Dis, 2012, 54(5): 451?454.

[7] 王福文, 趙敬國, 王 燕, 等. 力竭性運動后大鼠血清CK、CK-MB活性和心肌組織形態(tài)學(xué)的動態(tài)改變[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(1): 52?55, 134.

[8] Lin X, Jiang C, Luo Z,. Protective effect of erythropoietin on renal injury induced in rats by four weeks of exhaustive exercise[J]. BMC Nephrol, 2013, 14(1): 130.

[9] 韋小英, 馬 彬, 吳洪海, 等. 游泳運動對大鼠心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 28(4): 319?324.

[10] Lucena MC, Paniagua R. Structural changes in the rat myocardium after exhaustive exercise[J]. Acta Cardiol, 1984, 39 (1): 41?54.

[11] Lucena MC, Paniagua R. Effects of exercise to exhaustion in rat myocardium. A stereological study[J]. Acta Cardiol, 1984, 39(6): 463?477.

[12] Boulton TG, Yancopoulos GD, Gregory JS,. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control[J]. Sciences, 1990, 249(4964): 64?67.

[13] Boulton TG, Nye SH, Robbins DJ,. ERKs: a family of protein serine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF[J]. Cell, 1991, 65(4): 663?675.

[14] Torii S, Nakayama K, Yamamoto T,. Regulatory mechanisms and function of ERK MAP kinases[J]. J Biochem, 2004, 136(5): 557?561.

[15] Sugden PH, Clerk A. Oxidative stress and growth-regulating intracellular signaling pathways in cardiac myocytes[J]. Antioxid Redox Signal, 2006, 8(11-12): 2111?2124.

[16] Bueno OF, Molkentin JD. Involvement of extracellular signal-regulated kinases 1/2 in cardiac hypertrophy and cell death[J]. Circ Res, 2002, 91(9): 776?781.

（編輯: 張青山）

Protective effect of Xinfukang oral liquid on myocardial necrosis in rats following acute exhausted exercise

LIU Hai-Yan, WANG Chen-Yang, CUI Yu-Juan, ZHOU Yu-Wen, XU Peng, CAO Xue-Bin*

(Department of Cardiology, Research, Diagnosis and Treatment Center for Senior Cardiovascular Diseases, Chinese PLA No. 252 Hospital, Baoding 071000, China)

To observe cardiomyocyte necrosis in the rats induced by acute exhausted exercise and determine the protective effects of Xinfukang oral liquid (a traditional Chinese medicine) on the necrosis.A total of 40 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups: control group, the low dose Xinfukang oral liquid [5ml/(kg·d)]＋acute exhaustive group, the high dose Xinfukang oral liquid [10ml/(kg·d)]＋acute exhaustive group, and acute exhaustive group (＝10 for each group). The Xinfukang oral liquid groups were treated with Xinfukang oral liquid at corresponding doses for 6 weeks by intragastrical administration before model induction, and the rats from the control group and acute exhaustive group were given normal saline instead of Xinfukang oral liquid. Acute exhausted exercise was carried out according to the classical Thomas’ induction, and then identified by the rats’ behaviors and signs. Myocardial necrosis was observed by transmission electron microscopy. DNA ladder were detected to observe myocardial cell DNA degradation. Western blotting was used to analyze the expression of total extracellular signal-regulated kinase (ERK) and phosphorylated ERK (p-ERK) in all groups.Transmission electron microscopy indicated that exhausting exercise group showed significantly more serious mitochondria swelling, obvious myocardial necrosis and DNA degradation. Compared with exhausted group, pretreatment of Xinfukang oral liquid resulted in attenuated injury in both myocardial cells and DNA integrity, and a increased ratio of p-ERK expression(＜0.05).Pretreatment of Xinfukang oral liquid exerts a preventive effect on cardiomyocyte necrosis induced by acute exhaustive exercise.

Xinfukang oral liquid; acute exhaustive exercise; cardiomyocyte necrosis

(10ZYZ106).

R285.5

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00170

2013?07?24;

2013?08?23

軍隊中醫(yī)藥科研專項重點課題（10ZYZ106）

曹雪濱, E-mail: caoxb252@163.com

王晨陽, 為共同第一作者