賀艷艷　潘輝　王娟娟等

摘要：利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)擴增卡拉庫爾羊腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因，連接到pET-28b載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），在不同的IPTG濃度、時間、溫度條件下誘導TNF-α的表達。結(jié)果表明，原核表達載體pET-28b-TNF-α構(gòu)建成功，可在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，優(yōu)化的誘導表達條件為誘導溫度37 ℃、誘導時間4 h、IPTG濃度1.0 mmol/L。

關(guān)鍵詞：腫瘤壞死因子α（TNF-α）；原核表達；表達條件

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1686-03

腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）是一類具有多種生物學活性的細胞因子，在體內(nèi)具有特異性殺傷腫瘤細胞、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗寄生蟲、代謝調(diào)控、造血及炎癥前反應(yīng)等多種作用[1-3]。近年來對TNF-α及其阻斷劑在臨床應(yīng)用方面的研究獲得了可喜的成果[4-7]。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)擴增卡拉庫爾羊TNF-α基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）菌株，對TNF-α的表達條件進行優(yōu)化，以期為研究卡拉庫爾羊TNF-α在機體內(nèi)的作用、生物學活性及其在動物疾病治療、飼料開發(fā)等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株、表達載體pET-28b（+）均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、X-Gal、IPTG、dNTPs、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（AP）、Tris、TEMED等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α的構(gòu)建與鑒定 提取卡拉庫爾羊淋巴細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴增TNF-α基因，上下游引物分別為PF， 5′-GGCGAATTCCTCCCGTCTGGACTTGGATC-3′（劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點）；RF， 5′-GGCCTCG

AGGGACACCTTGACCTCCTGAAT-3′（劃線部分為Xho Ⅰ酶切位點）。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-28b原核表達載體?；厥蘸笥肨4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行酶切及測序鑒定。

1.2.2 卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白的誘導表達 將重組質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，后取1 μL轉(zhuǎn)接到100 μL新鮮的含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基。分別在不同的誘導溫度（37、39、42 ℃）、時間（1、2、3、4 h）和IPTG濃度（0.5、1.0、1.5 mmol/L）條件下進行TNF-α融合蛋白的誘導表達。誘導表達后收集1 mL表達菌，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入2×SDS緩沖液20 μL和2 μL 二硫蘇糖醇（DTT），渦旋混勻，12 000 r/min離心1 min，100 ℃加熱5 min以使蛋白質(zhì)變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測表達的融合蛋白[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴增卡拉庫爾羊TNF-α基因

以卡拉庫爾羊淋巴細胞RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用設(shè)計好的引物擴增得到卡拉庫爾羊TNF-α基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，擴增產(chǎn)物條帶清晰明亮，長度約為1 300 bp，與預期目標片段大小相符，測序結(jié)果表明得到的擴增產(chǎn)物長度為1 268 bp，與已知的TNF-α基因序列一致。

2.2 卡拉庫爾羊重組原核表達質(zhì)粒pET-28b-TNF-α的鑒定

將構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒pET-28b-TNF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑單菌落進行菌液PCR鑒定，對陽性菌落提取質(zhì)粒進行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，質(zhì)粒雙酶切后得到明顯的兩條條帶，大小分別為1 300 bp和5 000 bp左右。

2.3 TNF-α融合蛋白的誘導表達

將含有表達載體pET-28b-TNF-α的大腸桿菌BL21（DE3）菌株在不同溫度和時間條件下培養(yǎng)，添加不同濃度的IPTG進行TNF-α融合蛋白的誘導表達。SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物，結(jié)果見圖3。采用BandScan 5.0軟件對電泳結(jié)果進行分析，結(jié)果表明誘導溫度37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、誘導4 h時的蛋白表達量較高，占菌體蛋白表達量的21.6%（圖4）。

3 小結(jié)與討論

大腸桿菌BL21（DE3）表達系統(tǒng)是一個便捷的、能在體外高效表達真核基因的系統(tǒng)，該系統(tǒng)不能進行蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，因而對外源基因表達后大多數(shù)產(chǎn)物通常以包涵體形式存在，導致蛋白沒有活性。但大腸桿菌BL21（DE3）系統(tǒng)能讓研究者獲得較滿意的蛋白表達量，從而為以后的實驗提供大量的蛋白原料。

在原核表達系統(tǒng)中除了需要表達菌株，還需要表達載體，pET系列載體在原核表達載體中較為常用，可利用誘導劑IPTG對外源蛋白的表達進行調(diào)控。本實驗選用了技術(shù)非常成熟的融合型原核表達載體pET-28b，pET-28b全長5 369 bp，帶有卡那青霉素抗性篩選基因，該載體包括T7啟動子、LacZ操縱子序列、LacI調(diào)控基因、多克隆位點等。該載體還含有6個組氨酸標簽，當用Ni-NTA樹脂純化蛋白時，6個組氨酸標簽與其有很強的親和性，這樣有利于蛋白的純化。此外，融合表達能提高目的蛋白的表達量，降低外源蛋白對表達宿主菌細胞的毒性。

影響蛋白表達的因素很多[9-15]，本研究只選擇了3個，即誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度。溫度和時間是影響融合蛋白誘導表達的重要因素，選擇合適的誘導溫度和時間可以促進菌體的生長，提高產(chǎn)物的表達量。但培養(yǎng)時間過長會導致菌體代謝產(chǎn)生的毒素積累，從而影響菌體生長，降低蛋白的表達水平。IPTG對蛋白的表達有促進作用，其濃度過高也會抑制大腸桿菌的生長。本試驗結(jié)果表明，卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG的條件下誘導4 h，表達量達最高。

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