劉兆云 龍 逢 劉 苗 陳 星 常學潤 陳 剛

抑郁癥多巴胺受體DRD2基因突變檢測*

劉兆云1，2龍 逢1，2劉 苗1，2陳 星1常學潤3陳 剛1

目的對抑郁癥患者DRD2基因外顯子進行突變篩查。方法對DRD2基因的9個外顯子設計合成15對引物，將238例抑郁癥患者分為3組，分別構建3個DNA混合樣本(96例、96例與46例)。將1 095例正常對照者分為兩組，分別構建2個DNA混合樣本(95例和1 000例)。將上述5個DNA混合樣本作為DNA模板，先對其進行聚合酶鏈擴增，用Light Scanner高分辨率熔解曲線系統(tǒng)(HRM)篩查突變并確定TC值;對PCR產物稀釋40倍后作為模板進行COLD－PCR擴增后再進行HRM突變檢測。結果對患者組與兩個對照組熔解曲線逐一對比后未發(fā)現(xiàn)患者DRD2基因外顯子存在突變。結論抑郁癥的病因并非源于DRD2基因外顯子的突變。

抑郁癥 DRD2基因 突變 高分辨率熔解曲線分析

抑郁癥以情緒低落、興趣減低、悲觀厭世、思維遲緩、睡眠飲食差等為主要表現(xiàn)，嚴重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為，多數(shù)患者反復發(fā)作。在精神疾病中，抑郁癥的發(fā)病率僅次于精神分裂癥。世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization，WHO)調查結果顯示，其全球患病率約為3.1%［1］。美國哈佛大學、WHO和世界銀行合作開展的全球疾病負擔研究結果預測，2020年抑郁癥將成為全球第二大負擔疾?。?］。因此，抑郁癥研究越來越受到人們的重視。本研究采用 DNA Pooling、COLD－PCR以及高分辨率熔解曲線分析技術(HRMA)相結合的方法，對238例抑郁癥患者DRD2基因的全部外顯子區(qū)域進行了突變篩查，結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2006～2010年在山東省精神衛(wèi)生中心住院的抑郁癥患者(以下簡稱患者)238例，其中男性94例，女性144例，男女之比1∶1.53，年齡范圍14～81歲，平均年齡(44.77±16.96)歲，平均發(fā)病年齡(39.54±17.04)歲，患者間均無血緣關系。正常對照者1 095例(以下簡稱對照者)，分為95例與1 000例兩組，取自山東省血液中心獻血者。95例對照者中，男性48例，女性47例，男女之比為1.02∶1，年齡范圍18～55歲，平均年齡(26.03±6.84)歲;1 000例對照者中，男性569例，女性431例，男女之比為1.32∶1，年齡范圍17～55歲，平均年齡(23.08±5.67)歲。所有患者均符合國際疾病分類第10版(ICD－10)抑郁癥診斷標準。本研究得到了山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所倫理委員會的批準，并獲得了患者與對照者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 取患者與對照者的外周靜脈血，分別放入抗凝試管與抗凝袋中，之后－20℃冷凍保存。DNA提取采用廈門百維信生物科技有限公司 (Bio－V)的 Lab－Aid 820 自動核酸提取儀與 500 μl全血磁珠核酸提取試劑盒。DNA濃度用美國賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)的NanoDrop 2000分光光度計檢測，每個樣本測定兩次，取其平均值。如果兩次誤差超過10%，則進行第3次測定后取兩個相近數(shù)值的平均值。將所有DNA樣品稀釋至終濃度20 ng/μl。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)制作 將238例患者的DNA分別構建了3個DNA混合池樣本(96例、96例和46例);將對照者的DNA分別構建了2個DNA混合池樣本(95例和1 000例)。將患者組與對照組的每個個體取20 ng/μl濃度的DNA溶液10 μl進行混合，制成DNA混合池，最后，將所有DNA樣品稀釋至終濃度1 ng/μl，用96孔深孔板(2 ml)－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA模板分裝 用美國APRICOT DESIGNs Personal Pipette PP－550N－XD移液工作站將終濃度1 ng/μl的DNA溶液分裝5 μl至96孔PCR板(寧波)。1.2.4 引物設計與合成 用美國加州大學的基因組生物信息學網(wǎng)站UCSC Genome Bioinformatics(http://genome.ucsc.edu/cgi－bin/hgGateway)，輸入 DRD2基因，在眾多轉錄本中選擇最長(外顯子最多)的一個，通過Exon Primer(外顯子引物設計軟件)，選擇Entire(全部)cDNA后生成;引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，見表1。

表1 抑郁癥DRD2基因全部外顯子突變檢測引物序列

1.2.5 PCR反應 基因組 DNA 5 μl(1 ng/μl)，10×EasyTaq buffer 2.0 μl(Trans Gen Biotech 全式金)，10 mM dNTPs 0.8 μl，5 μM Primer(左右)各0.8 μl，5 μM SYTO9(飽和熒光染料)1.5 μl，Easy Taq polymerase(Trans Gen Biotech 全式金)(5 U/μl)0.2 μl，加ddH2O 8.9 μl使總反應體系為 20 μl。PCR 反應在Applied Biosystem，ABI公司(美國)GeneAmp PCR System 9700擴增儀上進行，其反應條件如下:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，56～59℃ 退火2 min，72℃延伸30 s，共50個循環(huán);然后72℃保溫7 min，最后保存于25℃。從PCR產物中取15 μl用于高分辨率熔解曲線分析，先確定PCR產物的Tm值，再制定相應PCR產物的Tc值(臨界解鏈溫度)(Tc=Tm－1)。將剩余的5 μl PCR產物加三蒸水200 μl稀釋后混勻，取5 μl用作Cold－PCR的DNA模板，其他試劑與PCR配方相同，總反應體系為20 μl。反應條件:95℃ 預變性2 min;95℃ 變性15 s、56℃退火2 min、72℃延伸1 min，共10個循環(huán);95℃ 變性15 s、70℃ 2 min(形成雜交異源雙鏈)、Tc溫度(每個具體PCR產物有所不同)變性10 s、56℃退火 30 s、72℃延伸 1 min，共40個循環(huán);最后保存于25℃。

1.2.6 高分辨率熔解曲線分析基因突變檢測(High Resolution Melting for Gene Scaning) 采用高分辨率熔

解曲線基因突變/基因分型檢測系統(tǒng)(Idaho Technology，Light Scanner HI 96)，溫度從65℃升至95℃。飽和熒光染料結合于DNA雙鏈之中，隨著溫度的逐漸上升，雙鏈PCR產物就會發(fā)生解鏈，熒光染料則會隨之開始脫落，直至完全解鏈后全部脫落，此過程會通過熒光曲線下降反映出來。如果對照者與患者在這一段PCR產物的DNA序列完全一致，那么二者的熔解曲線的形狀就會完全吻合;若患者的DNA存在突變，就會形成DNA異源雜合雙鏈，解鏈溫度會提前，或者呈現(xiàn)兩次解鏈，熔解曲線形狀也會發(fā)生相應改變。通過與對照者熔解曲線對比，可發(fā)現(xiàn)患者的這一段DNA序列是否存在突變。Erali等［3］對此有非常全面而詳盡的論述。

1.2.7 統(tǒng)計分析 所有15對引物擴增后PCR產物的基因掃描通過 Instrument＆Analysis軟件(Light Scanner wit Call－IT 2.0)完成。另外，患者組與對照組的一般統(tǒng)計學數(shù)據(jù)通過Microsoft Office Excel軟件完成。

2 結果

對238例抑郁癥患者的DRD2基因的9個外顯子的序列，用DNA混合池的方法，分別經過PCR與Cold PCR擴增后，經過高分辨率熔解曲線分析，均未發(fā)現(xiàn)突變。見圖1。

圖1 DRD2基因第6外顯子(Exon6)對照者與患者高分辨率熔解曲線圖

3 討論

從野生型與突變型混雜的DNA樣本中檢測出低豐度突變對腫瘤、遺傳、感染性疾病、產前診斷等研究至關重要［4，5］。在惡性腫瘤的病理檢材中，含突變的腫瘤細胞往往與大量癌旁正常組織細胞混雜在一起，即便通過顯微切割技術，也無法取到100%的腫瘤細胞，這就造成樣本中野生型(正常)DNA與腫瘤突變DNA的混雜。常規(guī)PCR幾乎以等效率擴增所有等位基因，sanger測序也只能檢出含10%以上的突變［6］。所以，在過去的20年里，研究人員不斷地進行探索，改進微量突變等位基因的檢出技術。Li J等［6］創(chuàng)立了能從大量野生型和突變型DNA的混和樣本中擴增出低豐度突變的低變性溫度下復合PCR技術(coamplication at lower denaturation temperature－ PCR COLD－PCR)，其原理是:在雙鏈DNA中任何位置的單核苷酸變異或錯配可使解鏈溫度(Tm)降低，臨界解鏈溫度(TC)比正常狀態(tài)下的Tm值低大約1℃，即Tc=Tm－1。當被擴增的DNA片段在70℃復性形成異源DNA雙鏈之后，如將變性溫度設為Tc，則含突變的DNA片段將會解鏈并得以擴增，而此時的變性溫度由于還未達到野生型DNA的解鏈溫度，因此，野生型DNA仍處于雙鏈狀態(tài)而得不到擴增。COLD－PCR技術非常靈敏，能檢測出混雜樣本中0.1%的突變［6］，所以，一經提出，便得到了廣泛的應用［7～9］。

DNA混合池技術最早用于對梅毒的大規(guī)模流行病調查［10］，后來在國際上逐漸被用于各種遺傳疾病的研究，尤其是對復雜性遺傳病的大樣本基因掃描關聯(lián)分析。這種方法可以大大減少工作量，降低研究成本，縮短研究周期。在國內，陳剛等［11～17］借助此技術對多種復雜性遺傳性疾病進行了關聯(lián)分析。DNA pooling將多個個體的DNA樣本混合在一起進行研究，如果一群患者中只有幾個個體存在突變，那么，從該樣本中檢出突變與從混有正常組織的腫瘤樣本中檢出低豐度突變的原理如出一轍。因此，將DNA pooling技術與COLD－PCR技術相結合，能將成百上千的患者與對照者分別混合起來進行研究，取代了對大量的個體進行逐一基因分型，從而提高了研究效率、節(jié)約了研究成本。多巴胺受體DRD2是許多抗精神病藥物的作用靶點，對抑郁癥患者的DRD2基因外顯子進行突變篩查有助于闡明抑郁癥的病因與發(fā)病機理。多巴胺受體(DAR)由7個跨膜區(qū)域組成，屬于與鳥苷酸結合蛋白(G蛋白)相偶聯(lián)受體家族。根據(jù)其與腺苷酸環(huán)化酶的相互作用，將腦內 DAR 分為 D1、D2兩大家族［18］。D1家族包括D1、D5兩種亞型，它們與Gs蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，升高細胞內cAMP水平。D2家族包括D2、D3、D43種亞型，它們與Gi/O蛋白偶聯(lián)，抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低細胞內 cAMP 水平［19，20］。

D2受體基因(DRD2)含415個氨基酸殘基，定位于 11q23.2，全長超過 270 kb。Eubanks等［21］當時發(fā)現(xiàn)該受體基因包含7個外顯子，6個內含子，基因轉錄時DRD2的選擇性剪切產生兩種mRNA。Usiello等［22］研究發(fā)現(xiàn)這兩種mRNA編碼的蛋白中，其中一個比另一個多29個氨基酸，所以將其分別命名為D2S(短型)與D2L(長型)。并且還發(fā)現(xiàn)在活體組織中這兩種亞型的分布及其功能有所不同，D2L主要在突觸后膜執(zhí)行功能，而D2S主要在突觸前膜發(fā)揮作用。

用受體放射自顯影定位技術，Meader－Woodruf發(fā)現(xiàn)DRD2主要分布于蒼白球、丘腦核團、基底核;在黑質、紋狀體和中腦腹側背蓋區(qū)也有表達。DA通過DRD2對中樞神經系統(tǒng)發(fā)揮調節(jié)作用，與藥物成癮、學習、記憶、以及神經精神疾病的發(fā)生有關［23］。Garriock等［23］對患者進行抗抑郁劑治療后發(fā)現(xiàn)其紋狀體、前扣帶回皮質和伏隔核的D2受體結合增加;另外，對D2受體的阻斷水平與抑郁癥的嚴重程度也呈相關性。Martin等［24］認為DRD2超敏或上調與抑郁癥的發(fā)生有關。

近年來，DRD2基因與抑郁癥的研究多集中于基因多態(tài)性的關聯(lián)方面。Neville等［25］發(fā)現(xiàn) Taq1A(rs1800497)位于11q23.1，DRD2基因的下游，其多態(tài)性通常指1個T(A1等位基因)替代C(A2等位基因)。Berman等［26］發(fā)現(xiàn)A2等位基因與12～16歲兒童抑郁癥的嚴重程度高度相關，卻與成年抑郁癥的相關性不明顯。Berman等［26］還發(fā)現(xiàn)攜帶有A1等位基因人群的腦多巴胺能獎賞系統(tǒng)縮小，從而能較好地緩解生活壓力事件的負面影響，維持情緒平衡。Elovainio等［27］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有A2等位基因的人在經受生活壓力事件(嚴重疾病、離婚、失業(yè)等)后比其他人更容易患抑郁癥。但這一結果存有爭議，Vaske等［28］認為生活壓力事件之間的作用與抑郁癥無關聯(lián);Huuhka等［29］發(fā)現(xiàn)C957T多態(tài)性與抑郁癥的嚴重程度相關。DRD2NcoI C/T多態(tài)性位于外顯子6，Peroutka等［30］發(fā)現(xiàn)與T/T基因型的個體相比，NcoI C/C基因型的個體患抑郁癥的比率明顯增高。

基因的外顯子先轉錄為mRNA，后翻譯成蛋白質。外顯子突變會影響基因的表達進而影響到神經系統(tǒng)的各個方面，最終導致疾病的發(fā)生。因此，對外顯子進行突變檢測將有助于對DRD2基因與抑郁癥發(fā)病機理的深入理解。本實驗結果雖未發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者DRD2基因的突變，但這對以后的研究有重要的參考價值，對此基因的研究既要重視外顯子部分(可擴大病例樣本量)，更要注重外顯子之外的DNA區(qū)域(如:啟動子區(qū)、調控區(qū)、以及內含子區(qū)等)，尤其是啟動子區(qū)域的甲基化，其異常直接關系到基因的開啟與關閉，結果可能會更為嚴重。

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Screening for mutations of DRD2gene in depressive patients.

LIU Zhaoyun，LONG Feng，LIU Miao，et al.Laboratory of Medical Genetics，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China

ObjectiveTo screen the mutations of DRD2gene in depressive patients.Methods15 pairs of primers covering all the 9 exonic sequences of DRD2gene were applied to amplify the 3 DNA pools of depressive patients(n=96，96 and 46 respectively)and 2 DNA pools of healthy controls(n=95 and 1 000 respectively).PCR products were scanned with high resolution melting curve analysis(HRM)and the critical melting temperature(Tc)was determined.PCR products were diluted 40 times as template for COLD－PCR amplification，then HRM was carried out again to compare the curve differences between depressive cases and healthy controls.ResultsMelting curve comparison did not reveal any mutation in depressive patients.ConclusionThe etiology of depression is not associated with exonic mutations of DRD2gene.

Depression DRD2Gene Mutation HRM

R749.4

A

1009－7201(2013)－05－0321－05

10.3969/j.issn.1009－7201.2013.05.001

國家自然科學基金項目(編號:30440042，30770780);山東省科技發(fā)展計劃項目(編號:2011GSF11821);山東省自然科學基金重點項目(編號:Z2004C10)

1.250062 濟南，山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 2.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院 3.山東省精神衛(wèi)生中心

陳剛，導師，研究員，E－mail:chengang560515@163.com

2013－05－07)