崔開艷 孫萌萌 劉蘭芬，2 楊麗敏 王 妍 喬冬冬 王汝展 王麗娜

精神分裂癥患者的認知功能缺陷，是精神分裂癥核心癥狀之一［1］，被認為是精神分裂癥的內(nèi)表型中很重要的組成部分，與精神分裂癥的其他臨床癥狀相比更穩(wěn)定，更具有可遺傳性，可能更接近精神分裂癥的生物學本質(zhì)［2］，因而對精神分裂癥認知功能的研究可能更有助于尋找和定位精神分裂癥的易感基因。在精神分裂癥的病因?qū)W中，神經(jīng)發(fā)育障礙假說近年備受重視。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最重要的成員之一，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的產(chǎn)生和維持發(fā)揮著重要作用。BDNF Val66Met基因的單核苷酸多態(tài)性即編碼多肽鏈上第66位纈氨酸(Val)的密碼子GUG被編碼蛋氨酸(Met)的密碼子AUG取代，從而引起中樞功能性BDNF的低表達。有研究顯示，BDNF Val66Met基因多態(tài)性可能在人類認知功能的損害中起到重要作用［3～5］，并且可能與認知功能相關的腦結構，如海馬、前額葉皮層［6，7］形態(tài)改變相關。然而既往研究的結果不一，并且其研究對象多為歐美人群，針對中國漢族人群的研究較少，我們選取中國漢族首發(fā)精神分裂癥患者和正常對照者作為研究對象，以探索中國漢族人群BDNF Val66Met基因多態(tài)性在精神分裂癥病因及病理機制中的作用及其與首發(fā)患者認知功能的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 精神分裂癥患者組(患者組):90例首發(fā)精神分裂癥患者，男46例，女性44例，年齡16～54歲，平均(26.16±8.90)歲。入組標準:符合美國精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂癥的診斷標準;首次發(fā)作;年齡16～60歲的漢族住院患者;入組前4周內(nèi)未使用抗精神病藥物，入組前6個月未接受過無抽搐電休克治療(MECT)。排除標準:合并嚴重軀體疾病者;符合DSM-Ⅳ診斷標準的其他精神疾病者。正常對照組(對照組):100名健康體檢者，男性59例，女性41例，年齡17～53歲，平均(25.4±5.8)歲。對照組入組標準:年齡16～60歲的中國漢族人群，既往無精神疾患史。排除標準:有嚴重軀體疾病者，妊娠或哺乳期婦女，家族史陽性者。兩組年齡及性別比例的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。該研究通過山東省精神衛(wèi)生中心倫理委員會的批準同意。所有入組人員均來自山東省漢族人群，均知情同意，精神分裂癥患者由本人及其監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 量表工具 (1)DSM-Ⅳ:用于精神分裂癥患者的診斷，由兩名工作5年以上的主治或主任醫(yī)師明確診斷。(2)精神分裂認知功能成套測驗共識版(MCCB):由美國國立精神衛(wèi)生研究院于2003年啟動的MATRCS計劃制定，2009年由北京回龍觀醫(yī)院鄒義壯等人將其翻譯成中文，其中文版信效度研究顯示與英文版在國外的測試結果基本一致，可作為評價精神分裂癥患者認知缺陷的標準化測量工具［8］。該測驗共包括10項分測驗，結構上形成7個心理維度:①處理速度:連線測驗、符號編碼測驗、語義流暢性測驗 ②注意/警覺:持續(xù)操作測驗;③工作記憶:數(shù)字序列測驗、空間廣度測驗;④語言學習和記憶:言語記憶測驗;⑤視覺學習和記憶:視覺學習記憶測驗;⑥推理與問題解決能力:迷宮測驗;⑦社會認知:情緒管理測驗。(3)威斯康星卡片分類測驗(WCST)評估精神分裂癥患者的執(zhí)行運動功能。

1.2.2 基因組DNA提取 抽取所有受試者晨7時空腹肘靜脈血5 ml，3 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，分離血清和白細胞，保存于-70℃待測;采用改良碘化鉀法提取DNA，保存于-70℃待測。

1.2.3 基因型鑒定 TaqMan法檢測SNP。PCR反應體系為 10 μl，包括 TaqMan PCR Master Mix 5 μl，2 ×引物 0.375 μl，2 × 探針 0.5 μl，2.25 μl雙蒸水，1 μl目標 DNA。正向引物 5＇-AAC ATC CGA GGA CAA

GGT GG-3＇;反向引物:5＇-GGA CAT GTT TGC AGC ATC TAG GTA A-3＇;供體雜交探針 5＇-GCT CTT CTA TCA CGT GTT CGA AAG TG-FL-3;受體雜交探針5＇-LC640-CAG CCA ATG ATG TCA AGC CTC TTG AAC CTG-PH-3＇。TaqMan法中所用到的兩條探針分別帶著不同的熒光報告基團FAM和HEX。通過收集、分析不同的熒光信號強度，分析SNP等位基因。如果樣本只有FAM或HEX熒光增強，其SNP分型為純合子;如果FAM和VIC同時增強，則為雜合子。對于熒光信號增強不明顯的樣本重復檢測。隨機挑選40例DNA樣本進行復孔檢測，結果一致率為 99.99%，說明TaqMan法進行SNPs基因型鑒定結果可靠。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理。連續(xù)型數(shù)值變量使用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述;采用擬合優(yōu)度卡方檢驗對不同基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗;采用卡方檢驗比較患者組與對照組基因型頻率和等位基因頻率是否不同;采用方差分析比較不同基因型精神分裂癥患者認知功能得分是否不同;采用LSD法進行兩兩多重比較。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡法則吻合度檢驗 兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，說明研究樣本為隨機樣本，具有群體代表性。

2.2 兩組基因型頻率及等位基因頻率分布比較 兩組基因型頻率和等位基因分布頻率差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.027，P=0.007);患者組 Met等位基因的頻率要高于對照組(P=0.007)。見表1。

表1 兩組BDNF Val66Met基因多態(tài)性基因型、等位基因頻率比較

2.3 不同BDNF基因型間精神分裂癥患者MCCB得分的比較 MCCB的10項測驗中只有連線錯誤數(shù)和空間廣度得分在3組不同基因型患者間的得分差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，進一步兩兩比較后發(fā)現(xiàn)Met/Met基因型患者的連線錯誤數(shù)大于Val/Val和Val/Met基因型者(P ＜0.05，P ＜0.01)，Val/Val基因型患者和Val/Met基因型的患者在連線錯誤數(shù)上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在空間廣度得分上發(fā)現(xiàn)Val/Val基因型者得分高于Val/Met和Met/Met基因型者 (P ＜0.05，P ＜0.01)，Val/Met和 Met/Met兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見表2。

2.4 不同BDNF基因型間精神分裂癥患者WCST得分的比較 WCST測驗中發(fā)現(xiàn)3種不同基因型患者正確應答數(shù)得分差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)Val/Val純合者的正確應答數(shù)高于Val/Met基因型者(P＜0.01)，而 Val/Val基因型者與Met/Met者及Val/Met者與Met/Met者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表2 患者組認知功能MCCB得分在BDNF基因型間的比較(x±s)

表3 患者組認知功能MCCB得分在BDNF基因型間的比較(x±s)

3 討論

精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育障礙假說認為在大腦的發(fā)育過程中，基因控制的異常分子水平可引起神經(jīng)元分化、遷移及突觸形態(tài)的改變，并導致個體今后對精神分裂癥的易感［9］。Egan 等［10］的研究顯示 BDNF Val66Met基因變異雖然不會影響成熟的BDNF功能，但是會對BDNF前體蛋白造成影響，這會導致中樞BDNF功能下降。Chen等［11］研究也顯示，BDNFMet變異不僅影響變異BDNF蛋白向神經(jīng)樹突細胞的分布及分泌，而且當正常BDNF蛋白與變異BDNF蛋白作用于同一神經(jīng)細胞時，變異的BDNF還可以影響正常BDNF蛋白的運輸。而BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達并且對其功能的產(chǎn)生和維持發(fā)揮著十分重要的作用，尤其是在海馬部位［12］。大量研究表明BDNF對與精神分裂癥發(fā)病機制密切相關的神經(jīng)元如海馬神經(jīng)元［13］、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元［14，15］、谷氨酸能神經(jīng)元［16］及 5-羥色胺能神經(jīng)元［17］起著營養(yǎng)支持作用，被認為可能與精神分裂癥的發(fā)病相關。本研究發(fā)現(xiàn)首發(fā)精神分裂癥BDNF Val66Met基因型頻率及等位基因分布頻率與正常對照者之間存在統(tǒng)計學差異，且Met/Met基因型及Met等位基因在精神分裂癥患者中的頻率均高于正常對照者，提示Met基因攜帶可能是精神分裂癥的危險因素，這一研究結果和國外相關研究是一致的［18，19］。然而，國內(nèi)外也有研究認為BDNF Val66Met基因多態(tài)性與精神分裂癥無相關［20～22］。既往研究結果不同的原因可能是:(1)由于所選研究對象的不同，因其地域或種族的不同，其基因分布頻率可能不同，也有研究證實BDNF Val66Met基因型頻率和等位基因頻率在不同人群中存在差異［23］。(2)可能是由于精神分裂癥存在遺傳異質(zhì)性，且目前精神分裂癥不是一個疾病單元，而是一組臨床綜合征，存在臨床異質(zhì)性有關。

精神分裂癥具有癥狀重疊，診斷一致性很低的臨床異質(zhì)性。雖然采用國際通用的分類系統(tǒng)和診斷標準，如DSM和ICD分類系統(tǒng)，但是目前所有的分類體系都是建立在臨床癥狀評定的基礎之上的，精神分裂癥不是一個疾病單元，而是一組臨床綜合征。臨床異質(zhì)性已經(jīng)成為困擾精神疾病病因?qū)W研究的一大障礙。許多學者認為精神分裂癥患者的神經(jīng)認知功能較其臨床癥狀更能反映疾病的本質(zhì)，可作為精神分裂癥病因?qū)W研究中“內(nèi)表型”之一。

既往有研究顯示:抗精神病藥物的使用可能對精神分裂癥患者的認知功能造成影響［24］，故我們選取未經(jīng)治療的首發(fā)精神分裂癥患者作為研究對象，以排除抗精神病藥物的影響。本研究應用MCCB對精神分裂癥患者的認知功能進行評估，比較分析不同基因型精神分裂癥患者的MCCB得分:在MCCB測驗中，反映患者處理速度的連線錯誤數(shù)和反映患者工作記憶功能的空間廣度得分及WCST卡片分類測驗中的正確應答數(shù)在3種不同基因型的患者間具有統(tǒng)計學差異;進一步兩兩比較后發(fā)現(xiàn)Met純合患者的連線錯誤數(shù)多于攜帶Val等位基因的患者;在空間廣度得分上，發(fā)現(xiàn)攜帶Met等位基因的患者要差于Val純合的患者;本研究結果提示:攜帶Met等位基因的精神分裂癥患者的處理速度、工作記憶可能更差，BDNF Met變異可能與首發(fā)精神分裂癥患者的處理速度及工作記憶認損害有關。本研究結果與既往歐美國家的研究基本是一致的。國外Ho等［25］的研究顯示:Met等位基因攜帶者的精神分裂癥患者認知損害更重，與其相對應的大腦顳葉和枕葉灰質(zhì)體積更小，該研究提示BDNF Met基因變異可能在精神分裂癥患者認知損害中有具有特定作，且BDNF基因變異、大腦結構損害及認知損害的關聯(lián)。Egan等［3］人的研究顯示，不論是在精神分裂癥患者還是在正常對照人群，攜帶Met等位基因者的學習記憶等認知功能及海馬結構均較 Val純合子差。Hariri等［4］的研究發(fā)現(xiàn)在正常人群中Met攜帶者空間廣度得分較Val純合子差，認為BDNF Val66Met多態(tài)性可能對正常人的認知功能有影響作用。然而Foltynie等［26］人的研究呈現(xiàn)相反的結果，他們認為Met攜帶能夠改善認知功能。

WCST卡片分類測驗是目前廣泛使用的一種檢測額葉執(zhí)行功能的測驗，反應患者的高級認知功能，受試者評分低提示其額葉受損，有執(zhí)行功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)3組不同基因型精神分裂癥患者在正確應答數(shù)一項上存在統(tǒng)計學差異，且Val/Met基因型的精神分裂癥患者其正確應答數(shù)要低于Val/Val純合的患者。提示BDNF Met變異可能與精神分裂癥患者的執(zhí)行障礙有關。精神分裂癥患者的腦影響學研究間接支持了本研究結果。Ho等［27］測量了119例精神分裂癥患者腦結構的改變，結果顯示Met基因攜帶者額葉體積減少比Val純合子患者更明顯，同時其側(cè)腦室的增大也更明顯，提示BDNF Met基因變異可能是導致精神分裂癥患者額葉體積變化的原因之一。而額葉可能與人類高級認知功能密切相關。然而，Rybakowski等［28］的研究認為BDNF Met基因變異可能與精神分裂癥患者的認知缺陷無關，而與雙向障礙患者的認知功能缺陷相關。既往研究結果存在差異的原因可能有:(1)BDNF Val66Met多態(tài)性只是與精神分裂癥患者的部分認知缺陷相關，而不是與所有的認知缺陷相關。(2)各研究所選擇的研究對象所存在的臨床異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，所選用的認知功能的檢測工具不同所造成的偏倚。(3)BDNF Val66Met基因多態(tài)性的作用可能受其他基因位點的干擾，有研究表明REST基因多態(tài)性影響B(tài)DNF Val66Met對認知功能的作用［29］。

總之，到目前為止，從流行病學到分子遺傳學研究，無可爭辯的證明遺傳因素是精神分裂癥最為重要的病因之一。本文的病例對照研究提供了進一步的證據(jù)支持BDNF Val66Met基因是精神分裂癥的易感基因，并發(fā)現(xiàn)BDNF Val66Met基因多態(tài)性與精神分裂癥認知缺陷內(nèi)表型之間的陽性關聯(lián)。本研究結果提示內(nèi)表型策略的運用和分子生物學技術的發(fā)展，有望在不久的將來在該領域取得突破。

本研究的局限性在于僅對BDNF Val66Met一個遺傳位點進行了研究，而精神分裂癥是多基因遺傳疾病;本研究的樣本量較小，故需在多基因遺傳位點、大樣本量的深入進一步研究。

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