劉芳容，王強(qiáng)，張靜，趙欣，3

（1.重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；3.釜山國立大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)科，韓國釜山 609－735）

苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的體外抗癌效果

劉芳容1，王強(qiáng)2，張靜1，趙欣2，3

（1.重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；3.釜山國立大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)科，韓國釜山 609－735）

對市售的苦丁茶進(jìn)行MCF－7人乳腺癌細(xì)胞體外抗癌效果和體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移效果評價(jià).通過MTT實(shí)驗(yàn)、DAPI熒光染色分析和RT－PCR分析說明其體外抗癌效果.200μg／mL苦丁茶（81%抑制率）水提物表現(xiàn)出對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞較強(qiáng)的生長抑制效果.200μg／mL比100和50μg／mL苦丁茶水提物具有更強(qiáng)的細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡效果，Bax，caspase－3和caspase－9的mRNA表達(dá)得到增強(qiáng)，Bcl－2表達(dá)減弱.苦丁茶水提物處理后炎癥相關(guān)因子NF－κB，iNOS和COX－2表達(dá)減弱，展示了苦丁茶的抗炎特性.由此得出，一定質(zhì)量濃度的苦丁茶具有良好的抗癌預(yù)防效果.

苦丁茶；MCF－7人乳腺癌細(xì)胞；抗癌

苦丁茶（Ilex kudingcha Tseng）是野生冬青科冬青屬常綠喬木，俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶，是中國南方地區(qū)經(jīng)常飲用的一類茶，是傳統(tǒng)的藥用植物［1］.苦丁茶作為傳統(tǒng)飲品和藥用植物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上具有清熱消暑、明目益智、生津止渴、利尿強(qiáng)心、潤喉止咳、降壓減肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脈等多種功效，是一種很好的醫(yī)藥保健飲料［2］.

苦丁茶中含有豐富的水提物，包括多酚類物質(zhì)、氨基酸，胡蘿卜素和維生素等，由于這些功能性成分的存在，在近年的研究中已經(jīng)表明苦丁茶具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)心血管、生殖和免疫系統(tǒng)的功效［3－5］.此外，還有研究表明苦丁茶對胃癌患者化療后靜脈炎有預(yù)防和治療作用［6］，并且還可以誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，起到抗癌效果［］.

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，惡性腫瘤與一些標(biāo)志物有關(guān)［8］，惡性腫瘤細(xì)胞到達(dá)其他部位繼續(xù)生長發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移從而危及病患生命，因此減少癌細(xì)胞增殖和防止腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥治療的途徑，除了醫(yī)學(xué)的治療手段外，通過堅(jiān)持食用保健食品預(yù)防和幫助治療乳腺癌已經(jīng)得到證實(shí)［9］.為了驗(yàn)證苦丁茶的抗癌效果，本研究初步驗(yàn)證苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞（MCF－7human breast adenocarcinoma cells）體外抗癌功能性作用和利用小鼠動物模型進(jìn)行苦丁茶的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究.

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

苦丁茶：市售苦丁茶，進(jìn)行冷凍干燥后用沸水3次提取后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R－114，瑞士Buchi公司）蒸干后得到水提物，將提取物用二甲基亞砜（DMSO，日本純正化學(xué)公司）溶解后待用.

1.2 癌細(xì)胞株培養(yǎng)

MCF－7人乳腺癌細(xì)胞購自ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國）.癌細(xì)胞在加有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清（FBC）和體積分?jǐn)?shù)1%的青霉素－鏈霉素溶液RPMI 1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）中置于含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的培養(yǎng)箱（MCO96，日本三洋電機(jī)公司）中培養(yǎng).每周更換2～3次培養(yǎng)基，6～7d傳代1次.

1.3 4，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）熒光染色法觀察癌細(xì)胞凋亡情況

MCF－7人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入不同質(zhì)量濃度苦丁茶水提取物樣品后再培養(yǎng)48h，癌細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為0.05%脻蛋白酶－0.02%乙二胺四乙酸（美國GIBCO公司）消化后，再用PBS洗后使用體積分?jǐn)?shù)為3.7%的多聚甲醇（paraformaldehyde，美國Sigma公司）常溫下用10min進(jìn)行細(xì)胞固定，然后用質(zhì)量濃度為1μg／mL的4，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI，美國Sigma公司）溶液染色10min.最后用PBS溶液漂洗染色后的細(xì)胞2次，熒光顯微鏡下（BXSO，日本奧林巴斯公司）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照分析［10］.

1.4 3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑嗅（MTT）法檢測癌細(xì)胞抑制效果

將培養(yǎng)的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞稀釋在培養(yǎng)基中并按1×104mL－1接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔加入180μL含癌細(xì)胞的培養(yǎng)基.在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個樣品設(shè)3個劑量組，質(zhì)量濃度分別為50，100，200μg／mL，細(xì)胞貼壁后每孔加入不同質(zhì)量濃度的20μL苦丁茶水提物.加入樣品繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg／mL的MTT試劑20μL，再置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，將各孔內(nèi)上清液棄去，按每孔150μL加入二甲基亞砜后震蕩30min，用酶標(biāo)儀（Elx800，美國Bio Tekinstruments公司）在540nm波長下測定各孔OD值，并按公式（抑制率＝［（空白孔OD值－樣品孔OD值）／空白孔OD值］×100%）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率［11－12］.

1.5 Reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR）分析

用DAPI分析法相同的程序準(zhǔn)備一定量的苦丁茶水提物處理后的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞，用RNAzol試劑（美國Invitrogen公司）提取癌細(xì)胞中的總RNA.將分離的RNA定量后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備ss cDNA，再以制備好的cDNA為模板，用RT－PCR法擴(kuò)增凋亡基因Bax，Bcl－2，caspase－3，caspase－9和炎癥基因NF－κB，IκB－α，iNOS，COX－2（表1）.glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase（GAPDH）持家基因作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn).然后按每mL瓊脂液中加入0.05μL溴化乙錠配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物［13－14］.

表1 RT－PCR引物序列Tab.1 Primers of RT－PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)表示為x±SD，數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SAS v9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采取Duncan's multiple range tests，P＜0.05有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 苦丁茶誘發(fā)MCF－7人乳腺癌細(xì)胞凋亡效果的形態(tài)觀察

DAPI細(xì)胞染色后，凋亡細(xì)胞核能發(fā)出藍(lán)色熒光，據(jù)此可以判斷細(xì)胞是否凋亡.對照組MCF－7細(xì)胞染色后細(xì)胞核邊緣清晰、著色均勻.經(jīng)不同質(zhì)量濃度苦丁茶水提物處理后的癌細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核濃染、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而200μg／mL苦丁茶水提物作用后最為明顯（圖1）.可見苦丁茶對誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡具有一定的效果，并且質(zhì)量濃度越高作用越明顯.

圖1 苦丁茶水提物對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞凋亡效果Fig.1 Apoptotic effect of Ilex kudingcha Tseng water extract on MCF－7human breast adenocarcinoma cells

2.2 苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞體外增殖的抑制效果

采用MTT法，檢測苦丁茶對MCF－7細(xì)胞的體外抗癌效果.結(jié)果顯示，苦丁茶水提取物對MCF－7細(xì)胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨樣品質(zhì)量濃度增加呈梯度增加.以200μg／mL的苦丁茶水提物處理MCF－7細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制率（81%）.以100，50μg／mL的苦丁茶水提物處理MCF－7細(xì)胞時(shí)，癌細(xì)胞生長抑制率為58%和19%（表2）.由此可見，苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞具有抑制增殖效果，濃度越高抑制效果越顯著.

表2 MTT法測定苦丁茶水提物對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的生長抑制效果Tab.2 Inhibition of the growth of MCF－7human breast adenocarcinoma cells by Ilex kudingcha Tseng water extract as evaluated by a MTT assay

2.3 苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的Bax和Bcl－2基因的mRNA表達(dá)影響

以不同質(zhì)量濃度的苦丁茶水提取物處理MCF－7人乳腺癌細(xì)胞，以200μg／mL質(zhì)量濃度水提物處理過的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞Bax表達(dá)最強(qiáng)，以100和50μg／mL質(zhì)量濃度處理過的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞中Bax表達(dá)呈現(xiàn)遞減的趨勢；Bal－2的mRNA表達(dá)中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度苦丁茶水提物處理后，隨著質(zhì)量濃度的升高表達(dá)減弱（圖2）.

圖2 經(jīng)苦丁茶水提物處理后MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的Bax和Bcl－2的mRNA表達(dá)Fig.2 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of Bax and Bcl－2in MCF－7human breast adenocarcioma cells

2.4 苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的caspase－3和caspase－9基因的mRNA表達(dá)影響

以苦丁茶水提取物處理MCF－7人乳腺癌細(xì)胞，觀察癌細(xì)胞的caspase－3和caspase－9表達(dá)，得到與Bax表達(dá)相似的結(jié)果，隨著處理細(xì)胞樣品質(zhì)量濃度的增加caspase－3和caspase－9也隨之增加，200μg／mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，表達(dá)最強(qiáng)（圖3）.由此可以看出，在200μg／mL質(zhì)量濃度處理下苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于其他質(zhì)量濃度.

圖3 經(jīng)苦丁茶水提物處理后MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的caspase－3和caspase－9的mRNA表達(dá)Fig.3 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of caspase－3and caspase－9 in MCF－7human breast adenocarcinoma cells

2.5 苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的NF－κB和IκB－α基因的mRNA表達(dá)影響

通過苦丁茶水提取物處理MCF－7人乳腺癌細(xì)胞觀察苦丁茶的抗炎效果，以200μg／mL質(zhì)量濃度處理過的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞NF－κB表達(dá)最弱，以100和50μg／mL質(zhì)量濃度處理過的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞中Bax表達(dá)呈現(xiàn)隨質(zhì)量濃度減小表達(dá)增加的趨勢；IκB－α的mRNA表達(dá)中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度樣品處理后，表現(xiàn)出與NF－κB表達(dá)相反的趨勢，隨著質(zhì)量濃度的升高表達(dá)增加（圖4）.

圖4 經(jīng)苦丁茶水提物處理后MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的NF－κB和IκB－α的mRNA表達(dá)Fig.4 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of NF－κB and IκB－αin MCF－7human breast adenocarcinoma cells

2.6 苦丁茶對MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的iNOS和COX－2基因的mRNA表達(dá)影響

以苦丁茶水提取物處理MCF－7人乳腺癌細(xì)胞，觀察癌細(xì)胞炎癥相關(guān)因子iNOS和COX－2，發(fā)現(xiàn)隨著處理細(xì)胞樣品質(zhì)量濃度的增加表達(dá)隨之減弱，200μg／mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，表達(dá)最弱，100和50μg／mL質(zhì)量濃度處理的細(xì)胞表達(dá)也弱于沒有經(jīng)過樣品處理過的對照細(xì)胞（圖5）.由此可以看出，經(jīng)苦丁茶水提物處理過的MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的抗炎作用強(qiáng)于未經(jīng)處理的癌細(xì)胞，并且隨苦丁茶水提物質(zhì)量濃度的增加，抗炎效果也增加.

圖5 經(jīng)苦丁茶水提物處理后MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的iNOS和COX－2的mRNA表達(dá)Fig.5 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of iNOS and COX－2in MCF－7human breast adenocarcinoma cells

3 討論

苦丁茶作為一種保健茶葉飲品，其部分功能已經(jīng)得到證實(shí).對癌細(xì)胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預(yù)防效果.本文中隨著苦丁茶樣品質(zhì)量濃度的增加MCF－7人乳腺癌細(xì)胞的增值減少，證明苦丁茶可以明顯地在體外抑制癌細(xì)胞的生長.細(xì)胞凋亡是在生理或病理?xiàng)l件下，由基因調(diào)控的細(xì)胞主動程序化死亡的過程［15］.在癌癥發(fā)生過程中凋亡相關(guān)基因的突變或表達(dá)異?？梢宰钄喟┘?xì)胞的凋亡，促使癌癥發(fā)生［16］.Bcl－2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用.Bcl－2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對量高于Bcl－2時(shí)，Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡［17］.本研究中隨著處理癌細(xì)胞的苦丁茶水提物質(zhì)量濃度的增加，癌細(xì)胞的Bax表達(dá)加強(qiáng)，Bcl表達(dá)減弱，可以認(rèn)為苦丁茶能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而起到對乳腺癌的預(yù)防作用.Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡，caspase－9為凋亡途徑的上游caspase，caspase－3為下游caspase，caspase－9作為啟動性caspase，隨著表達(dá)的加強(qiáng)可以加強(qiáng)對下游caspase－3的激活，caspase－3可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡［18］.由此可以看出苦丁茶對癌細(xì)胞的caspase－3和9的作用是可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡.腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位，通過血液、淋巴運(yùn)轉(zhuǎn)或直接播散到不連續(xù)的組織器官中繼續(xù)生長，形成與原發(fā)腫瘤病理類型相同的腫瘤［19］.COX－2，iNOS是啟動子區(qū)域含NF－kB結(jié)合位點(diǎn)的2種誘生型酶，三者之間存在著密切的關(guān)系.NF－kB作為一種重要的多向性核轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控著多種基因的表達(dá)，并參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程.環(huán)氧合酶－2（COX－2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）為2種誘生型酶，在大多數(shù)組織中不表達(dá)，但在一些炎癥性細(xì)胞因子、生長因子、內(nèi)毒素及促癌劑等的作用下呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，從而發(fā)揮其病理作用［20－21］.苦丁茶富含具有抗氧化、清除自由基的維生素C、維生素E和生物類黃酮等生物活性物質(zhì)，能削弱自由基對人體的危害，增加肌體免疫力，具有防癌抗癌的作用.苦丁茶還含有多種人體必需的微量元素，其中硒具有抗氧化、抗病毒、抗癌作用［22］.特別是苦丁茶含有的類黃酮物質(zhì)可能是抗癌功效最強(qiáng)的成分，這些類黃酮物質(zhì)通過抗氧化、自由基清除和對二價(jià)陰離子的螯合作用實(shí)現(xiàn)抗氧化和抗癌作用［23］.本文對苦丁茶進(jìn)行了體外抗癌效能的比較實(shí)驗(yàn)，得出苦丁茶具有抗癌效果的結(jié)果.苦丁茶對人體的臨床作用有待更深層次的研究.

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

In Vitro anticancer effect of Ilex kudingcha Tseng in MCF－7 human breast adenocarcinoma cells

LlU Fangrong1，WANG Qiang2，ZHANG Jing1，ZHAO Xin2，3
（1.Department of Gynecologic Oncology，Chongqing Cancer Hospital，Chongqing 400030，China；2.Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China；3.Department of Food Science and Nutrition，Pusan National University，Busan 609－735，Republic of Korea）

One Ilex kudingcha Tseng product was purchased for the evaluation of in vitro anticancer effect in MCF－7human breast adenocarcinoma cells and in vivo anti－metastatic effect.In MTT assay，apoptosis analysis by DAPI staining and RT－PCR，western blot gene expressions were employed to check their in vitro anticancer effect and in vivo anti－metastatic effect were measured using a animal model.At the mass concentration of 200μg／mL，I.kudingcha Tseng water extract（81%inhibitory rate）showed the best inhibitory effect on the growth of MCF－7human breast adenocarcinoma cells.I.kudingcha Tseng water extract（200μg／mL）significantly induced apoptosis，up－regulated mRNA expressions of Bax，caspase－3and caspase－9，and down－regulated Bcl－2expression，compard with 100and 50μg／mL of I.kudingcha Tseng water extract.The expression of genes associated with inflammation，NF－κB，iNOS，andCOX－2was significantly downregulated by I.kudingcha Tseng，demonstrationg its anti－inflammatory properties.These results suggest that I.kudingcha Tseng showed good cancer preventive effect.

Ilex kudingcha Tseng；MCF－7human breast adenocarcinoma cells；anticancer

Q813

A

1000－1565（2013）02－0185－08

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.014

2012－09－12

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（CSTC2012jjA80002）；重慶教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ121504）

劉芳容（1972－），女，重慶人，重慶市腫瘤醫(yī)院主管護(hù)師，主要從事腫瘤護(hù)理研究.

趙欣（1981－），男，蒙古族，重慶人，重慶第二師范學(xué)院講師，主要從事保健食品抗癌功能性研究.E－mail：foods＠live.cn