汪東劍，張曉云，江丁

(中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西鷹潭335000)

乳汁成分對(duì)乙型肝炎病毒DNA檢測(cè)的影響

汪東劍，張曉云，江丁

(中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西鷹潭335000)

目的探討乳汁成分對(duì)乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）檢測(cè)的影響以及乙肝病毒DNA在乳汁中的分布情況，為建立可行、標(biāo)準(zhǔn)的乳汁HBV DNA檢測(cè)方法提供依據(jù)。方法建立乳汁成分干擾模型、生理鹽水對(duì)照模型，比較干擾模型與對(duì)照模型中的HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果。在HBV-DNA陰性乳汁中摻入高中低值標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA陽(yáng)性血清，分別取樣本乳酪層、乳清與沉淀進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)。結(jié)果乳酪、乳清、沉淀干擾模型分別與鹽水對(duì)照模型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪、乳清、沉淀干擾模型間相互比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在摻入高值和中值標(biāo)準(zhǔn)血清時(shí)，HBV-DNA在乳酪、乳清和沉淀中的測(cè)定結(jié)果兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中沉淀中的測(cè)定結(jié)果最高，其次為乳清，最低的為乳酪層；在摻入低值標(biāo)準(zhǔn)血清后，除乳酪與沉淀中的HBV-DNA測(cè)定結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論乳汁主要成分對(duì)于乳汁樣本中HBV-DNA的檢測(cè)具有干擾作用，使得測(cè)定值低于實(shí)際值。乳汁樣本中HBV-DNA主要存在于沉淀部分，乳清、乳酪中也同時(shí)存在HBV-DNA。

乙型肝炎病毒；DNA；乳汁

我國(guó)是一個(gè)乙肝大國(guó)，乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者高達(dá)1.4億。母嬰傳播是乙肝的重要傳播途徑。在我國(guó)孕婦中乙型肝炎病毒攜帶者為10%~20%，而母嬰傳播途徑最活躍的因素就是乳汁傳播。HBV-DNA定量檢測(cè)是乙型肝炎攜帶者是否具有傳染性的金標(biāo)準(zhǔn)，因此不少學(xué)者致力于乳汁標(biāo)本中HBV-DNA的檢測(cè)，以確定母乳喂養(yǎng)是否安全可靠[1]。然而，乳汁組成復(fù)雜，富含脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖[2]，且乳汁為渾濁非勻相液體，與血清不同，因而適用于血清標(biāo)本中HBV-DNA檢測(cè)的方法是否適用于乳汁標(biāo)本有待探討。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的乳汁中HBV DNA檢測(cè)程序，各學(xué)者采用的研究方法和結(jié)果不盡相同。建立標(biāo)準(zhǔn)化的乳汁中HBV DNA檢測(cè)方法勢(shì)在必行。本研究?jī)H從乳汁成分對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)HBV DNA的影響及HBV DNA在乳汁中分布情況著手，以期為乳汁中HBV DNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰性乳汁收集2012年6~12月我院婦產(chǎn)科分娩產(chǎn)婦乳汁30份，經(jīng)乙型肝炎血清標(biāo)志物及HBV-DNA檢測(cè)均為陰性，確定乳汁中不攜帶乙型肝炎病毒。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清從2012年6~12月來(lái)我院就診進(jìn)行血清HBV-DNA檢測(cè)標(biāo)本中，留取30份無(wú)溶血、無(wú)黃疸、無(wú)脂血陽(yáng)性標(biāo)本，充分混勻后，平行進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)10次，取均值3.97×107IU/ml作為該混合血清的HBV-DNA定量值。將該混合血清分裝于1.5 ml Eppendorf管備用。

1.3 方法

1.3.1 乳汁干擾實(shí)驗(yàn)乳汁于冰箱中靜置24 h。乳汁分為三層：最上層為乳酪層（脂肪顆粒為主），中間為乳清（蛋白質(zhì)、糖類為主），底部為有形成分沉淀。根據(jù)乳汁性狀特點(diǎn)，建立乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀干擾模型如下：取HBV-DNA陰性乳汁8 ml取上中下三層各700μl于3只Eppendorf管中，每管加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清各700μl制成乳汁成分干擾模型；同時(shí)取無(wú)菌生理鹽水700μl與700μl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清加入Eppendorf管中制成對(duì)照模型，將四種模型充分震蕩混勻備用。每種模型按照血清HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法同時(shí)平行檢測(cè)HBV-DNA10次。

1.3.2 乳汁中HBV-DNA的分布情況取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用無(wú)菌生理鹽水稀釋10、100、1 000倍，制成高、中、低三種濃度標(biāo)準(zhǔn)血清模板，每種濃度取100μl于Eppendorf管中(平行做10份)，每管分別加入900μl HBV-DNA陰性乳汁，震蕩混勻，12 000轉(zhuǎn)離心10 min，分別取離心后的乳酪、乳清、沉淀部分各100μl加入新的Eppendorf管中，每管加入100μl DNA濃縮液。震蕩混勻后12 000轉(zhuǎn)離心10 min；去上清，沉淀加入DNA提取液20μl，100℃干浴10 min；冷卻后12 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液2μl加入PCR反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

1.4 主要試劑和儀器HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），達(dá)安7600 PCR擴(kuò)增儀，杭州奧康K30B干式恒溫器，姜堰新康XK96-B快速混勻器，上海安亭TGL-168高速離心機(jī)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS12.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳汁成分干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀擾模型與生理鹽水對(duì)照模型比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀干擾模型間相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以生理鹽水對(duì)照模型HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算乳酪、乳清、沉淀三組干擾模型中HBV-DNA的回收率分別為43.8%、53.6%、41.0%(回收率=干擾模型HBV-DNA測(cè)定結(jié)果/對(duì)照模型HBV-DNA測(cè)定結(jié)果)×100%)，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道不一致[3]。而三種干擾模型間相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乳汁干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 乳汁成分干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測(cè)結(jié)果比較在摻入高值和中值標(biāo)準(zhǔn)血清時(shí)，HBV-DNA在乳酪層、乳清和沉淀中的測(cè)定結(jié)果兩兩比較P<0.05，其中沉淀中的測(cè)定結(jié)果最高，其次為乳清，最低的為乳酪層；在摻入低值標(biāo)準(zhǔn)血清后，除乳酪層與沉淀中的HBV-DNA測(cè)定結(jié)果P<0.05外，其余P>0.05，見表2。

表2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測(cè)結(jié)果比較

表2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測(cè)結(jié)果比較

注：a為乳酪層與乳清比較，b為乳清與沉淀比較，c為乳酪層與沉淀比較。

組別樣本類型t值P值高值中值低值乳酪層乳清沉淀乳酪層乳清沉淀乳酪層乳清沉淀結(jié)果測(cè)定值（IU/ml）(1.87±0.26)×105(3.37±1.21)×105(7.65±0.82)×105(1.94±0.49)×104(2.58±0.36)×104(3.05±0.25)×104(2.27±0.55)×103(2.67±1.11)×103(2.76±0.46)×103對(duì)數(shù)值5.27±0.07 5.49±0.22 5.88±0.05 4.28±0.11 4.41±0.06 4.48±0.04 3.35±0.11 3.39±0.20 3.44±0.08 3.58a7.17b8.40c2.84a2.82b6.03c1.58a0.92b4.78c<0.05a<0.05b<0.05c<0.05a<0.05b<0.05c>0.05a>0.05b<0.05c

3 討論

國(guó)內(nèi)對(duì)于乳汁HBV-DNA檢測(cè)的研究大多集中于乳汁中攜帶乙肝病毒與母乳喂養(yǎng)安全方面，且對(duì)于乳汁中HBV DNA檢測(cè)的方法并不一致，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性難以衡量。本次研究旨在探討乳汁成分對(duì)HBV-DNA檢測(cè)是否具有影響以及乙肝病毒顆粒在乳汁中分布的情況，以期為建立可行、標(biāo)準(zhǔn)的乳汁標(biāo)本HBV-DNA檢測(cè)方法提供依據(jù)。

目前國(guó)內(nèi)外大多臨床實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA，其試劑及操作程序僅相對(duì)于血清樣本。由于乳汁中含有大量脂肪顆粒、蛋白質(zhì)、上皮細(xì)胞及其他有形成分，使得我們對(duì)于乳汁樣本HBV DNA的檢測(cè)不能簡(jiǎn)單的按照血清樣本的檢測(cè)方法進(jìn)行。

我們首先考慮的是乳汁樣本成分的復(fù)雜性是否會(huì)影響樣本中HBV-DNA的檢測(cè)。為此，我們收集HBV-DNA陰性的乳汁標(biāo)本，經(jīng)自然沉淀后，分別在乳酪層、乳清、沉淀中摻入等量標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清制成干擾模型，以無(wú)菌生理鹽水摻入等量標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清制成對(duì)照模型。通過(guò)測(cè)定四種模型中的HBV-DNA，我們發(fā)現(xiàn)，三種干擾模型中HBV DNA的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照模型相比，P<0.05，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)計(jì)算三種模型中HBV-DNA的回收率，發(fā)現(xiàn)三種模型的回收率分別為43.8%、53.6%、41.0%，同樣反映出乳汁主要成分對(duì)于乳汁樣本中HBV-DNA的檢測(cè)具有干擾作用，使得測(cè)定結(jié)果低于實(shí)際值。但是，三種干擾模型的結(jié)果相互比較，發(fā)現(xiàn)彼此間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此認(rèn)為，乳汁中對(duì)HBV DNA檢測(cè)的影響是共性的，經(jīng)自然沉淀后所形成的三層主要成分對(duì)于HBV DNA檢測(cè)具有相似的干擾作用。乳汁成分對(duì)HBV-DNA檢測(cè)的干擾作用可能作用于以下環(huán)節(jié)：(1)在HBV-DNA的濃縮沉淀過(guò)程中，由于乳汁中富含的脂肪和蛋白質(zhì)和有形物質(zhì)，使?jié)饪s液無(wú)法完全將樣本中所含的核酸完全沉淀，從而使部分核酸隨離心后的上清液被遺棄導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。(2)由于乳汁中含有大量蛋白質(zhì)、糖類，使得乳汁的比例大于血清樣本，我們所使用的12 000轉(zhuǎn)離心所產(chǎn)生的離心力不足以使乳汁中存在的核酸完全沉淀，一部分隨離心后上清液被遺棄導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。(3)在核酸抽提過(guò)程中，由于我們濃縮沉淀過(guò)程中收集到的沉淀數(shù)量較多，使加入的DNA提取液不能完全抽提沉淀中HBV DNA，離心后部分HBV-DNA仍然存在于沉淀中，無(wú)法進(jìn)入上清液，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。(4)乳汁樣本中富含的脂類物質(zhì)、蛋白未被完全處理，隨著HBV-DNA模板一起進(jìn)入到PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，從而產(chǎn)生抑制作用，使得檢測(cè)結(jié)果偏低。(5)由于乳汁中乳糖含量豐富，而多糖是一類PCR抑制物[4]，使得乳汁樣本中HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果偏低。有研究將乳汁中所含的脂肪顆粒作為影響乳汁樣本HBV-DNA檢測(cè)的主要因素[5]，而本次試驗(yàn)中，脂肪顆粒含量最高的乳酪干擾模型與乳清、沉淀干擾模型中HBV-DNA的檢出結(jié)果差異并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明脂肪顆粒是影響HBV-DNA檢測(cè)的因素之一，但不是決定性影響因素，乳汁樣本對(duì)于HBV-DNA檢測(cè)的影響是由脂肪顆粒、乳清成分（蛋白質(zhì)、糖類）以及乳汁中的有形成分共同造成的。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乙肝病毒在乳汁中分布是不均勻的，但對(duì)于是主要分布在乳清還是沉淀部分存在爭(zhēng)議[6-7]。在本次研究中，我們對(duì)于摻入高中低三種標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行分析，分別檢測(cè)其乳酪層、乳清及沉淀中的HBV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)沉淀中HBV-DNA含量最高，其次為乳清，乳酪層最低，三者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(在摻入低值血清的乳汁中，乳酪層與乳清，乳清與沉淀間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但乳酪層與沉淀間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。通過(guò)乳汁中HBV-DNA分布情況的研究，我們認(rèn)為乳汁是一類特殊的樣本，即不同于血清均勻分布，又不同于其他體液完全集中于沉淀中，我們?cè)谂R床檢測(cè)中，以乳清或者沉淀替代乳汁整體來(lái)進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)都是不可取的，并不能真實(shí)反映整個(gè)乳汁樣本中的HBV-DNA載量。

對(duì)于乳汁中HBV-DNA的檢測(cè)，即要充分考慮乳汁成分對(duì)于檢測(cè)的影響，又要考慮到HBV DNA在乳汁中的分布特點(diǎn)。而文獻(xiàn)報(bào)道中所采用的檢測(cè)方法往往只顧及其中一種因素甚至沒有考慮這些因素[8-9]，因此，有必要對(duì)乳汁樣本中HBV-DNA檢測(cè)的方法進(jìn)行研究和改進(jìn)，使得我們得到的結(jié)果能真實(shí)反映出待測(cè)樣本中HBV-DNA的載量。

[1]張春和,金艷,郭愛蘭,等.產(chǎn)婦乳汁HBV標(biāo)志物含量、HBV-DNA載量相關(guān)性與母乳喂養(yǎng)安全性的研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(5):108-110.

[2]韓立強(qiáng),龐坤,劉愛清,等.鄭州市婦女乳汁中營(yíng)養(yǎng)及活性成分的測(cè)定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,45(1):59-61.

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[4]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2011:71.

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Influence of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA.

WANG Dong-jian,ZHANG Xiao-yun, JIANGDing.DepartmentofClinicalLaboratory,theNo.184HospitalofthePLA,Yingtan335000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the influence of the compositions of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA and the distribution of HBV-DNA in the human breast milk,and to provide the basis to set up a feasible and standard method for the quantitative detection of HBV-DNA in the human breast milk.MethodsWe set up the models interfere with cheese,whey,sediment and the compared model of physiological saline,and contrasted the HBV-DNA quantitative detection of interferential-model with compared-model. Then we mixed the high-value,mid-value and low-value standard HBV-DNA positive serum with HBV-DNA negative breast milk,and detected the HBV-DNA load in the cheese,whey and sediment.ResultsContrasted the HBV-DNA quantitative detection of the cheese interferential-model,whey interferential-model,sediment interferential-model with the physiological saline compared-model,the value of t were 3.30,3.00 and 4.60,and the value of P were less than 0.05.Contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese interferential-model,whey interferential-model and sediment interferential-model,the value of P were greater than 0.05.In the condition of mixed negative breast milk with high-value and mid-value standard serum,contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese,whey and sediment,the value of P were less than 0.05,and the quantity of HBV-DNA in the sediment was highest,in the whey was secondly and in the cheese was lowest.In the condition of mixed negative breast milk with low-value standard serum,the value of P were greater than 0.05 except the value of P contrasted between cheese and sediment was less than 0.05.ConclusionThe compositions of human breast milk can interfere the quantitative detect of HBV-DNA,which makes the estimated value less than the actual value.The HBV-DNA mostly exists in the sediment,also in the cheese and whey.

Hepatitis B virus;DNA;Human breast milk

R512.6+2

A

1003—6350（2013）16—2409—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.16.0993

2013-02-27）

張曉云。E-mail:w2013wdj184@163.com