吳劍鋒，徐迪暉，趙海金

（1.解放軍廣州療養(yǎng)院，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化科，廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院呼吸科，廣州 510515）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病共有的病理變化，表現(xiàn)為膠原為主的細胞外基質（extracelluar matrix，ECM）在肝臟過度的沉積。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活是HF的中心關鍵環(huán)節(jié)，HSCs被激活后，其表型向肌成纖維細胞轉化，合成大量α－SMA、膠原等基質成分而參與HF的發(fā)生發(fā)展［1］。糖尿病和HF關系密切，一方面慢性肝病可影響糖代謝；另一方面，近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會促進慢性肝病HF的進展，是發(fā)生肝硬化的一個重要危險因素［2，3］。探討高血糖在HF發(fā)病中的作用及其機制，有助于發(fā)現(xiàn)防治HF的新策略。本實驗通過體外高糖（模擬糖尿病高血糖）處理人HSCs，觀察研究高糖對人HSCs的活化作用及其機制，為臨床防治糖尿病相關HF提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

D－葡萄糖、甘露醇購自Sigma Aldrich公司（USA），DMEM培養(yǎng)基以及特級胎牛血清（FBS）購自 Gibco BRL（USA），抗 TGF－β1抗體購自 Abcam（Cambridge，UK，ab64715），抗 MMP－2 抗體購自Sigma Aldrich（St.Louis，MO，SAB4501891），抗I型膠原抗體購自Abcam（ab34710），抗α－SMA抗體購自Santa Cruz Biotechnology（CA，sc－130619）。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理方法

HSCs細胞由中山大學實驗動物中心提供。在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實驗分組：正常對照組（normal glucose group，NG，5.5mmol／L葡萄糖）、高糖組（high glucose group，HG，30mmol／L葡萄糖）和滲透壓對照組（osmolality control group，OC，5.5mmol／L葡萄糖＋19.5mmol／L甘露醇）。

1.3 Western blot測定蛋白的表達

HSCs細胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS洗2次，加入細胞裂解液，4℃靜置30min，12 000r／min離心10min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5h，隨后加入抗 TGF－β1、MMP－2、I型膠原和α－SMA抗體（1∶1 000），4℃過夜，用TBST洗3次，10min／次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

1.4 ELISA法測定TGF－β1的分泌水平

采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測培養(yǎng)基中TGF－β1的水平。HSCs細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當80%融合時，分別給予不同的條件處理培養(yǎng)基，每組3個復孔。處理完成后，取100μL培養(yǎng)基加入預先用TGF－β1抗體包被的酶標板中，37℃孵育90min，然后吸出培養(yǎng)基，加入TGF－β1抗體繼續(xù)孵育60min，經(jīng)TBS漂洗3次，加入生物素標記的Ⅱ抗，反應30min，采用TMB法顯色，經(jīng)終止液終止反應后，用酶標儀（Muhiscan MK3，Thermo Labsystems）記錄450nm波長處的吸光度。取3孔標準化處理后的A值進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖誘導HSCs細胞α－SMA表達上調

高糖處理HSCs細胞48h后，與NG組比較，α－SMA表達顯著升高（見圖1）；α－SMA是肌成纖維細胞的標志之一，該結果提示高糖可以誘導HSCs細胞活化。所有實驗重復至少3次。

2.2 高糖引起HSCs細胞MMP－2和I型膠原表達上調

I型膠原是ECM的主要成分，而活化的HSCs細胞是合成I型膠原的主要細胞；HSCs細胞高糖暴露48h后，I型膠原表達明顯增加（見圖2）。MMP在 HF時表達升高，其中 MMP－2主要由HSCs細胞分泌表達；高糖刺激HSCs細胞48h，MMP－2表達顯著升高（見圖3）。

圖1 高糖誘導上調HSCs細胞α－SMA的表達

圖2 高糖增加HSCs細胞I型膠原的表達

2.3 高糖促進HSCs細胞TGF－β1的分泌

TGF－β1在器官纖維化中有關鍵性作用，激活的HSCs細胞可以分泌 TGF－β1。本研究發(fā)現(xiàn)，HSCs細胞在高糖刺激48h后，培養(yǎng)上清液中TGF－β1的表達明顯增加（見圖4）。

圖3 高糖上調HSCs細胞MMP－2的表達

圖4 高糖促進HSCs細胞TGF－β1的產生

3 討論

慢性肝病和各種因素引起的肝損傷，最終修復創(chuàng)傷的結果是HF，其本質是ECM合成超過降解的病理過程，也是各種肝病和肝損傷導致肝硬化的共同通路［4］。研究證實，糖尿病高血糖有促進肝臟、腎臟和血管等器官纖維化的作用，而HF又影響機體糖代謝，二者互為因果，相互促進［5，6］。糖尿病性肝病作為糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，是指糖尿病引起肝臟組織結構和功能的病理變化（包括HF）。

研究證實，HSCs在HF發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，其激活和增殖是HF的中心環(huán)節(jié)，激活的HSCs表型轉變?yōu)榧±w維母細胞，特異性表達α－SMA（是HSCs激活的標志，在靜止期HSCs中無明顯表達，也是HSCs激活程度和HF進展的一個重要指標），合成大量 ECM 促進 HF［7－9］。

本研究結果顯示：高糖處理HSCs后可以誘發(fā)α－SMA、I型膠原和 MMP－2表達上調，提示高糖可以激活HSCs而促進 HF；此外，TGF－β1在 HF中有重要作用，可以誘導HSCs表型轉變?yōu)榉置谀z原的肌纖維母細胞，而HSCs也可以分泌TGF－β1，進而加重肝細胞損傷［10］；高糖刺激可以誘導HSCs分泌TGF－β1增加；高糖激活HSCs可能是通過TGF－β1信號通路。

綜上所述，高糖可以激活人HSCs，進而促進HF的發(fā)生，其機制可能是通過TGF－β1通路。進一步深入研究高血糖和HF相互影響的內在機制，有助于發(fā)現(xiàn)防治糖尿病性HF的新策略，為糖尿病性肝損傷機制提供新的實驗依據(jù)。

［1］蔡曉波，范建高，田麗艷，等.高血糖大鼠肝纖維肝臟氧化還原狀態(tài)的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21（20）：2725－2726.

［2］范建高，田麗艷，蔡曉波，等.高血糖對四氯化碳中毒大鼠肝纖維化進展的影響［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（1）：58－60.

［3］蔡曉波，范建高，田麗艷，等.高血糖對大鼠肝星狀細胞活化及轉化生長因子－β1和結締組織生長因子表達的影響［J］.肝臟，2006，11（2）：96－97.

［4］李芹，鄧存良，陳莊，等.高糖，胰島素對大鼠肝星狀細胞增殖影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2009，19（11）：1669－1672.

［5］羅潔，許輝，劉毅.高糖高脂誘導新西蘭兔肝纖維化的實驗研究［J］.實用預防醫(yī)學，2007，14（2）：311－315.

［6］蔡曉波，范建高.高血糖對肝纖維化發(fā)生的影響及其機制［J］.國外醫(yī)學（消化系疾病分冊），2005，25（5）：281－283.

［7］劉銀利，吳濤，毛美絨，等.高血糖對大鼠肝纖維化及肝星狀細胞活化的影響［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（1）：6－9.

［8］李芹，鄧存良.高血糖，肝星狀細胞與肝纖維化［J］.醫(yī)學綜述，2008，14（6）：888－889.

［9］樊雪強，陳新華，齊曉艷.靶向結締組織生長因子的siRNA對于肝星狀細胞介導纖維化的研究進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2012，9（35）：55－57.

［10］方瑜潔，萇新明.高血糖對肝纖維化大鼠肝組織α－SMA和CTGF表達的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（7）：1－4.