牦牛乳酪蛋白膠束琥珀?；揎椦芯?/h1>
2013-08-07 09:13:56楊繼濤
食品工業(yè)科技 2013年15期
楊 敏，梁 琪，楊繼濤，張 媛
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)
牦牛是青藏高原特有的優(yōu)勢畜種，長期生活在海拔3000m 以上無污染的高寒草原，牦牛乳是不折不扣的天然綠色食品，也是青藏高原地區(qū)牧民最主要的生活物資來源。近年來，世界牦牛乳年產(chǎn)量已增加至4000 萬t，使得這一獨特資源越來越受到眾多學(xué)者的關(guān)注［1-4］。牛乳經(jīng)脫脂、酸沉淀、脫水、干燥后制成粉末狀制品即為酪蛋白，又稱干酪素。酪蛋白及其制品有著較高的營養(yǎng)價值和良好的功能特性，適合作為乳化劑、增稠劑和營養(yǎng)強化劑等，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)［1，5］。甘肅省是全國最大的酪蛋白生產(chǎn)基地，有酪蛋白生產(chǎn)企業(yè)12 家，均以牦牛乳為原料，年產(chǎn)牦牛乳酪蛋白1.35 萬t 以上，占全國酪蛋白總產(chǎn)量的90%以上。蛋白質(zhì)的酰胺化作用具有顯著改變蛋白質(zhì)的凈電荷，從而改善其乳化性、溶解性、凝膠性等功能特性的作用［6-7］。琥珀酸酐具有低毒、安全性高等優(yōu)點，是蛋白質(zhì)改性用的主要?；噭?，其反應(yīng)原理如圖1 所示。琥珀酰化修飾不僅可以增加酪蛋白膠束的凈負電荷，還能顯著提高其乳化性能［8］。
圖1 蛋白質(zhì)琥珀?；磻?yīng)原理Fig.1 Succinylation reaction principle of protein
為了提高牦牛乳酪蛋白的功能特性，擴大其應(yīng)用范圍，本研究以琥珀酸酐為?；噭?，以牦牛乳酪蛋白為原料，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了?；に嚕@得了最佳?；瘲l件，并測定了修飾酪蛋白的乳化特性。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
牦牛乳酪蛋白 由甘肅華羚生物科技有限公司提供，其中酪蛋白含量為94.20%，水分含量為3.12%;乙醇、丁二酸酐、琥珀酸酐 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;氫氧化鈉 天津市化學(xué)試劑三廠;鹽酸 天津市化學(xué)試劑三廠;十二烷基磺酸鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠。
UV-2100 雙光束紫外-可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器(集團)有限責任公司;精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市順化儀器有限公司;PHS-3C-01 實驗室pH 計 上海三信儀表廠;立式高速冷凍離心機(KR25i) 法國Jouan 公司;XHF-D 型內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 牦牛乳酪蛋白溶解 準確稱取1.0000g 牦牛乳酪蛋白，加入100mL 去離子水中，在40℃磁力攪拌下并用1.0mol·L-1NaOH 溶液不斷調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定在7.0 直至酪蛋白完全溶解，備用。
1.2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；に噧?yōu)化
1.2.2.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 設(shè)定琥珀酸酐:酪蛋白(g/g)分別為0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1，采用2.0mol/L 和1.0mol·L-1的NaOH 溶液調(diào)節(jié)酪蛋白溶液pH 至8.0，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為50min，在磁力攪拌下分多次加入琥珀酸酐，并保持溶液pH 穩(wěn)定在8.0，反應(yīng)結(jié)束后將溶液定容至250mL，考察酪蛋白的酰化程度，每個水平重復(fù)三次，下同。
1.2.2.2 ?；痯H 的選擇 將反應(yīng)pH 分別設(shè)定為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，采用優(yōu)化后的最佳配比，其他反應(yīng)條件同1.2.2.1，考察酪蛋白的?；潭?。
1.2.2.3 ?；瘻囟鹊倪x擇 設(shè)定反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70、80℃，采用優(yōu)化后的最佳配比和pH，反應(yīng)時間為50min，考察酪蛋白的酰化程度。
1.2.2.4 ?；瘯r間的選擇 設(shè)定反應(yīng)時間分別為30、40、50、60、70、80min，采用優(yōu)化后的最佳配比、pH 和反應(yīng)溫度，考察酪蛋白的酰化程度。
1.2.3 酰化程度的測定 酪蛋白?；潭炔捎密崛壬y定，參照賈俊強等的方法并進行修改［9-10］。
茚三酮比色法:移取酪蛋白溶液1.00mL，加入2%(w/v)茚三酮溶液1.00mL，混合液于沸水浴中加熱5min，迅速冷至室溫，加入5.00mL 蒸餾水，在580nm 波長下測定溶液的吸光度，蒸餾水做參比液。
式中:Y 為?；潭?，%;a 為未酰化蛋白溶液的吸光度;b 為?；鞍兹芤旱奈舛取?/p>
1.2.4 ?；业鞍椎闹苽?用1.0mol·L-1HCl 溶液將?；罄业鞍兹芤簆H 調(diào)至等電點，于3500 ×g 離心15min，棄去上清液，將沉淀置于鋼制托盤進行冷凍干燥，溫度為-50℃，壓強為500 ～600Pa，時間為24h，得到白色粉末狀?；业鞍字破罚瑐溆?。
1.2.5 乳化性的測定 取6.00mL 濃度為2mg/mL 的?；业鞍兹芤?溶解方法同1.2.1)與2.00mL 一級精煉大豆油混合于試管中，于20000r/min 均質(zhì)1min，分別在0min 和靜置10min 時從距離試管底部0.5cm 處取50μL 乳液并與5mL 質(zhì)量濃度為1g/L 的SDS 溶液混勻，以濃度為1g/L SDS 溶液做參比，于500nm 處測定吸光度［11］。
乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI 的計算公式如下:
式中，C 為乳化前酪蛋白溶液的濃度，g/mL;D 為稀釋倍數(shù)，100;Φ 為乳液中油相的體積分數(shù)，0.25;A0為乳液靜置0min 的吸光度;A10為乳液靜置10min 的吸光度。
1.2.6 響應(yīng)面設(shè)計 考慮到琥珀酸酐用量增大致使?；潭仍黾又饕谟诜磻?yīng)物濃度增加使反應(yīng)程度增大，與反應(yīng)條件交互作用不大，因此固定琥珀酸酐與酪蛋白的配比，采用Box-Behnken 設(shè)計方法，設(shè)計三因素三水平共17 次獨立實驗，其中析因部分實驗次數(shù)為12 次，中心點重復(fù)實驗為5 次，用以估算實驗誤差。響應(yīng)曲面因子及水平見表1。
表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM
1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)均為3 次實驗的平均值，以平均值±標準差表示;數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析;利用Design Expert 8.0.6 進行響應(yīng)曲面實驗設(shè)計及分析，采用Origin 8.0 作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗結(jié)果
2.1.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 琥珀酸酐與酪蛋白的配比對?；潭鹊挠绊懭鐖D2 所示。
圖2 琥珀酸酐與酪蛋白配比對酰化程度的影響Fig.2 Effect of succinic anhydride-casein ratio on the modified degree
由圖2 可以看出，?；潭入S琥珀酸酐用量的增加而增大。當琥珀酸酐與酪蛋白質(zhì)量比為0.6 ∶1時，酰化程度為84.75%，當配比為0.8∶1 時，?；潭葹?5.45%，較配比為0.6∶1 時雖然有所增加，但是增大幅度較小，僅增加了0.82%，且差異不顯著(p ＞0.05)。由此可見，隨著琥珀酸酐用量的增加，酰化程度增大，這是因為反應(yīng)物濃度增大致使化學(xué)反應(yīng)程度增加。但是當配比達到0.6∶1 后，?；潭仍黾臃葮O小，此時游離氨基已經(jīng)基本反應(yīng)完全，剩余的少量氨基可能被緊密包埋于酪蛋白膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法完成?；磻?yīng)，因此，繼續(xù)增大琥珀酸酐用量，?；潭仍龃蠓容^小。綜合考慮?；潭燃霸铣杀荆晁狒c酪蛋白質(zhì)量比為0.6∶1 為最佳配比。
2.1.2 ?；痯H 的選擇 反應(yīng)pH 對酰化程度的影響如圖3 所示。
圖3 反應(yīng)pH 對酰化程度的影響Fig.3 Effect of pH on the modified degree
由圖3 可以看出，反應(yīng)體系pH 在堿性條件下酪蛋白?；潭容^高，pH 為8.0 ～10.0 時?；潭容^高，這是弱堿性條件利于酰胺化反應(yīng)。隨著pH 的增大，酪蛋白單體帶上負電荷，單體間靜電斥力增大，膠束的解離作用增強，單體解離程度增大［12-15］，游離氨基裸露程度增加，利于酰胺化反應(yīng)。但是，堿性過強時，琥珀酸酐水解后被大量堿中和，使體系中琥珀酸酐濃度迅速降低，?；潭蕊@著降低。本實驗選擇9.0 為最佳反應(yīng)pH。
2.1.3 酰化溫度的選擇 反應(yīng)溫度對?；潭鹊挠绊懭鐖D4 所示。
由圖4 可以看出，反應(yīng)溫度為40～50℃時酰化程度最高。溫度過低，琥珀酸酐水解速率較慢，?；磻?yīng)速率也較慢，酰化程度較低。當溫度過高時，琥珀酸酐水解迅速，水解產(chǎn)生的酸易促使酪蛋白沉淀，不利于?；磻?yīng);另一方面，酪蛋白膠束在高溫加熱時易于聚集［16-17］，從而使?；潭冉档?。考慮到能耗成本，選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度。
2.1.4 ?；瘯r間的選擇 反應(yīng)時間對酰化程度的影響如圖5 所示。
圖4 反應(yīng)溫度對?；潭鹊挠绊慒ig.4 Effect of temperature on the acylation degree
圖5 反應(yīng)時間對?；潭鹊挠绊慒ig.5 Effect of reaction time on the acylation degree
由圖5 可以看出，當反應(yīng)時間為50min 時，酪蛋白?；潭茸罡?。隨著時間的延長，酪蛋白膠束在長時間熱處理下發(fā)生聚集［16-17］，致使部分氨基被包埋于膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法酰胺化，酪蛋白?；潭冉档?。由此可見，?；磻?yīng)時間為50min 即可。
2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；瘲l件的響應(yīng)面法優(yōu)化
2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)曲面設(shè)計及實驗結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM
表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Result of regression and variance analysis
2.2.2 擬合模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到牦牛乳酪蛋白琥珀?；潭葘Ψ磻?yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH 的實際值全變量二次多項回歸模型方程為:
在三種因素中，溫度對?；潭扔绊懽畲?，時間的影響最小。
2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析及優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)回歸分析結(jié)果得出當琥珀酸酐與酪蛋白配比固定為0.6∶1 時，A、B、C 及各因素之間的交互作用對酪蛋白酰化程度的影響如圖6 所示。
從圖6a 可以看出，固定pH 為9.0，隨著溫度的升高，?；潭认仍黾?，后減小，溫度對?；潭鹊挠绊戄^明顯。隨著反應(yīng)時間的延長，酰化程度增大幅度趨于平緩甚至有所降低，可見部分酪蛋白在熱處理下隨著處理時間的延長聚集程度增大，游離氨基包埋量增加，酰化程度有所降低。當溫度約為42℃、時間約為50min 時，?；潭冗_到最大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明時間與溫度的交互作用對酰化程度影響較大。由圖6b 可以看出，反應(yīng)時間固定為50min 時，pH 對酰化程度的影響呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在弱堿性環(huán)境中酰化程度較大。隨著溫度的升高，等高線密度增大，隨著pH 的增大，等高線密度基本不變，說明溫度對酰化程度的影響大于pH。由圖6c 可以看出，pH 與時間交互作用的等高線基本呈現(xiàn)圓形，說明交互作用對?；潭扔绊懖伙@著。
圖6 各因素及交互作用對?；潭鹊挠绊慒ig.6 Response surface of factors and interactions on the degree of acylation
利用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析可知，當琥珀酸酐與酪蛋白配比為0.6，反應(yīng)溫度為41.92℃，反應(yīng)時間為49.20min，pH 為8.84 時，響應(yīng)面有最優(yōu)值，為86.32% ±0.97%。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的準確性和可靠性，又考慮到實際操作的便利，將最優(yōu)條件修正為:反應(yīng)溫度為42℃，反應(yīng)時間為49min，pH 為8.8，在修正后的優(yōu)化反應(yīng)條件下，酪蛋白的琥珀酰化程度為86.01% ±0.33%。
2.3 牦牛乳酰化酪蛋白乳化性分析
牦牛乳酪蛋白在琥珀?；揎椙昂蟮娜榛匦砸姳?。
表4 牦牛乳酪蛋白及琥珀?；业鞍兹榛€(wěn)定性和乳化活性Table 4 EAI and ESI values of modified yak caseins and unmodified yak casein
由表4 可以看出，琥珀?；揎楋@著改善了牦牛乳酪蛋白的乳化特性(p ＜0.01)。與未?；业鞍紫啾龋；业鞍兹榛€(wěn)定性增加了161.64%，乳化活性增加了98.54%。眾所周知，蛋白質(zhì)的乳化性與其結(jié)構(gòu)密不可分，其親水區(qū)域與水相互作用，疏水區(qū)域與油相互作用，從而體現(xiàn)出一定的乳化特性。琥珀?；揎楋@著增加了酪蛋白的凈負電荷，使得膠束結(jié)構(gòu)伸展［8］。牛乳酪蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，其單體肽鏈疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域完全分離，分子本身具有一定的疏水性［18-19］。在琥珀?；揎椬饔孟?，游離氨基形成了親水性更強的琥珀酰胺基，使得酪蛋白肽鏈的親水性區(qū)域的親水性增強，從而減緩了乳濁液中油水兩相的分離、聚集和分層的速率。因此，琥珀?；揎楋@著改善了酪蛋白的乳化性。
3 結(jié)論
對牦牛乳酪蛋白進行了琥珀?；揎棧捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化了?；に?，得出最佳反應(yīng)條件為溫度42℃，反應(yīng)時間49min，pH8.8;在最優(yōu)條件下，牦牛乳酪蛋白的琥珀酰化程度約86.01%。酪蛋白琥珀?；磻?yīng)條件溫和，參數(shù)可調(diào)范圍較大，易于調(diào)節(jié)和控制，?；揎棾潭雀摺?/p>
琥珀?；揎椩黾恿死业鞍啄z束的凈負電荷，使其結(jié)構(gòu)伸展，親水性增強，乳化穩(wěn)定性和乳化活性顯著改善，分別提高了161.64%和98.54%。因此，修飾酪蛋白可作為性能優(yōu)良的乳化劑。然而，琥珀酸酐雖然毒性較低，但其并非食品添加劑，琥珀?；揎椑业鞍啄芊裼糜谑称饭I(yè)還需對其食用安全性進行評估。
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圖1 蛋白質(zhì)琥珀?；磻?yīng)原理Fig.1 Succinylation reaction principle of protein
為了提高牦牛乳酪蛋白的功能特性，擴大其應(yīng)用范圍，本研究以琥珀酸酐為?；噭?，以牦牛乳酪蛋白為原料，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了?；に嚕@得了最佳?；瘲l件，并測定了修飾酪蛋白的乳化特性。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
牦牛乳酪蛋白 由甘肅華羚生物科技有限公司提供，其中酪蛋白含量為94.20%，水分含量為3.12%;乙醇、丁二酸酐、琥珀酸酐 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;氫氧化鈉 天津市化學(xué)試劑三廠;鹽酸 天津市化學(xué)試劑三廠;十二烷基磺酸鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠。
UV-2100 雙光束紫外-可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器(集團)有限責任公司;精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市順化儀器有限公司;PHS-3C-01 實驗室pH 計 上海三信儀表廠;立式高速冷凍離心機(KR25i) 法國Jouan 公司;XHF-D 型內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 牦牛乳酪蛋白溶解 準確稱取1.0000g 牦牛乳酪蛋白，加入100mL 去離子水中，在40℃磁力攪拌下并用1.0mol·L-1NaOH 溶液不斷調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定在7.0 直至酪蛋白完全溶解，備用。
1.2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；に噧?yōu)化
1.2.2.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 設(shè)定琥珀酸酐:酪蛋白(g/g)分別為0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1，采用2.0mol/L 和1.0mol·L-1的NaOH 溶液調(diào)節(jié)酪蛋白溶液pH 至8.0，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為50min，在磁力攪拌下分多次加入琥珀酸酐，并保持溶液pH 穩(wěn)定在8.0，反應(yīng)結(jié)束后將溶液定容至250mL，考察酪蛋白的酰化程度，每個水平重復(fù)三次，下同。
1.2.2.2 ?；痯H 的選擇 將反應(yīng)pH 分別設(shè)定為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，采用優(yōu)化后的最佳配比，其他反應(yīng)條件同1.2.2.1，考察酪蛋白的?；潭?。
1.2.2.3 ?；瘻囟鹊倪x擇 設(shè)定反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70、80℃，采用優(yōu)化后的最佳配比和pH，反應(yīng)時間為50min，考察酪蛋白的酰化程度。
1.2.2.4 ?；瘯r間的選擇 設(shè)定反應(yīng)時間分別為30、40、50、60、70、80min，采用優(yōu)化后的最佳配比、pH 和反應(yīng)溫度，考察酪蛋白的酰化程度。
1.2.3 酰化程度的測定 酪蛋白?；潭炔捎密崛壬y定，參照賈俊強等的方法并進行修改［9-10］。
茚三酮比色法:移取酪蛋白溶液1.00mL，加入2%(w/v)茚三酮溶液1.00mL，混合液于沸水浴中加熱5min，迅速冷至室溫，加入5.00mL 蒸餾水，在580nm 波長下測定溶液的吸光度，蒸餾水做參比液。
式中:Y 為?；潭?，%;a 為未酰化蛋白溶液的吸光度;b 為?；鞍兹芤旱奈舛取?/p>
1.2.4 ?；业鞍椎闹苽?用1.0mol·L-1HCl 溶液將?；罄业鞍兹芤簆H 調(diào)至等電點，于3500 ×g 離心15min，棄去上清液，將沉淀置于鋼制托盤進行冷凍干燥，溫度為-50℃，壓強為500 ～600Pa，時間為24h，得到白色粉末狀?；业鞍字破罚瑐溆?。
1.2.5 乳化性的測定 取6.00mL 濃度為2mg/mL 的?；业鞍兹芤?溶解方法同1.2.1)與2.00mL 一級精煉大豆油混合于試管中，于20000r/min 均質(zhì)1min，分別在0min 和靜置10min 時從距離試管底部0.5cm 處取50μL 乳液并與5mL 質(zhì)量濃度為1g/L 的SDS 溶液混勻，以濃度為1g/L SDS 溶液做參比，于500nm 處測定吸光度［11］。
乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI 的計算公式如下:
式中，C 為乳化前酪蛋白溶液的濃度，g/mL;D 為稀釋倍數(shù)，100;Φ 為乳液中油相的體積分數(shù)，0.25;A0為乳液靜置0min 的吸光度;A10為乳液靜置10min 的吸光度。
1.2.6 響應(yīng)面設(shè)計 考慮到琥珀酸酐用量增大致使?；潭仍黾又饕谟诜磻?yīng)物濃度增加使反應(yīng)程度增大，與反應(yīng)條件交互作用不大，因此固定琥珀酸酐與酪蛋白的配比，采用Box-Behnken 設(shè)計方法，設(shè)計三因素三水平共17 次獨立實驗，其中析因部分實驗次數(shù)為12 次，中心點重復(fù)實驗為5 次，用以估算實驗誤差。響應(yīng)曲面因子及水平見表1。
表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM
1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)均為3 次實驗的平均值，以平均值±標準差表示;數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析;利用Design Expert 8.0.6 進行響應(yīng)曲面實驗設(shè)計及分析，采用Origin 8.0 作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗結(jié)果
2.1.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 琥珀酸酐與酪蛋白的配比對?；潭鹊挠绊懭鐖D2 所示。
圖2 琥珀酸酐與酪蛋白配比對酰化程度的影響Fig.2 Effect of succinic anhydride-casein ratio on the modified degree
由圖2 可以看出，?；潭入S琥珀酸酐用量的增加而增大。當琥珀酸酐與酪蛋白質(zhì)量比為0.6 ∶1時，酰化程度為84.75%，當配比為0.8∶1 時，?；潭葹?5.45%，較配比為0.6∶1 時雖然有所增加，但是增大幅度較小，僅增加了0.82%，且差異不顯著(p ＞0.05)。由此可見，隨著琥珀酸酐用量的增加，酰化程度增大，這是因為反應(yīng)物濃度增大致使化學(xué)反應(yīng)程度增加。但是當配比達到0.6∶1 后，?；潭仍黾臃葮O小，此時游離氨基已經(jīng)基本反應(yīng)完全，剩余的少量氨基可能被緊密包埋于酪蛋白膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法完成?；磻?yīng)，因此，繼續(xù)增大琥珀酸酐用量，?；潭仍龃蠓容^小。綜合考慮?；潭燃霸铣杀荆晁狒c酪蛋白質(zhì)量比為0.6∶1 為最佳配比。
2.1.2 ?；痯H 的選擇 反應(yīng)pH 對酰化程度的影響如圖3 所示。
圖3 反應(yīng)pH 對酰化程度的影響Fig.3 Effect of pH on the modified degree
由圖3 可以看出，反應(yīng)體系pH 在堿性條件下酪蛋白?；潭容^高，pH 為8.0 ～10.0 時?；潭容^高，這是弱堿性條件利于酰胺化反應(yīng)。隨著pH 的增大，酪蛋白單體帶上負電荷，單體間靜電斥力增大，膠束的解離作用增強，單體解離程度增大［12-15］，游離氨基裸露程度增加，利于酰胺化反應(yīng)。但是，堿性過強時，琥珀酸酐水解后被大量堿中和，使體系中琥珀酸酐濃度迅速降低，?；潭蕊@著降低。本實驗選擇9.0 為最佳反應(yīng)pH。
2.1.3 酰化溫度的選擇 反應(yīng)溫度對?；潭鹊挠绊懭鐖D4 所示。
由圖4 可以看出，反應(yīng)溫度為40～50℃時酰化程度最高。溫度過低，琥珀酸酐水解速率較慢，?；磻?yīng)速率也較慢，酰化程度較低。當溫度過高時，琥珀酸酐水解迅速，水解產(chǎn)生的酸易促使酪蛋白沉淀，不利于?；磻?yīng);另一方面，酪蛋白膠束在高溫加熱時易于聚集［16-17］，從而使?；潭冉档?。考慮到能耗成本，選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度。
2.1.4 ?；瘯r間的選擇 反應(yīng)時間對酰化程度的影響如圖5 所示。
圖4 反應(yīng)溫度對?；潭鹊挠绊慒ig.4 Effect of temperature on the acylation degree
圖5 反應(yīng)時間對?；潭鹊挠绊慒ig.5 Effect of reaction time on the acylation degree
由圖5 可以看出，當反應(yīng)時間為50min 時，酪蛋白?；潭茸罡?。隨著時間的延長，酪蛋白膠束在長時間熱處理下發(fā)生聚集［16-17］，致使部分氨基被包埋于膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法酰胺化，酪蛋白?；潭冉档?。由此可見，?；磻?yīng)時間為50min 即可。
2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；瘲l件的響應(yīng)面法優(yōu)化
2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)曲面設(shè)計及實驗結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM
表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Result of regression and variance analysis
2.2.2 擬合模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到牦牛乳酪蛋白琥珀?；潭葘Ψ磻?yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH 的實際值全變量二次多項回歸模型方程為:
在三種因素中，溫度對?；潭扔绊懽畲?，時間的影響最小。
2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析及優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)回歸分析結(jié)果得出當琥珀酸酐與酪蛋白配比固定為0.6∶1 時，A、B、C 及各因素之間的交互作用對酪蛋白酰化程度的影響如圖6 所示。
從圖6a 可以看出，固定pH 為9.0，隨著溫度的升高，?；潭认仍黾?，后減小，溫度對?；潭鹊挠绊戄^明顯。隨著反應(yīng)時間的延長，酰化程度增大幅度趨于平緩甚至有所降低，可見部分酪蛋白在熱處理下隨著處理時間的延長聚集程度增大，游離氨基包埋量增加，酰化程度有所降低。當溫度約為42℃、時間約為50min 時，?；潭冗_到最大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明時間與溫度的交互作用對酰化程度影響較大。由圖6b 可以看出，反應(yīng)時間固定為50min 時，pH 對酰化程度的影響呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在弱堿性環(huán)境中酰化程度較大。隨著溫度的升高，等高線密度增大，隨著pH 的增大，等高線密度基本不變，說明溫度對酰化程度的影響大于pH。由圖6c 可以看出，pH 與時間交互作用的等高線基本呈現(xiàn)圓形，說明交互作用對?；潭扔绊懖伙@著。
圖6 各因素及交互作用對?；潭鹊挠绊慒ig.6 Response surface of factors and interactions on the degree of acylation
利用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析可知，當琥珀酸酐與酪蛋白配比為0.6，反應(yīng)溫度為41.92℃，反應(yīng)時間為49.20min，pH 為8.84 時，響應(yīng)面有最優(yōu)值，為86.32% ±0.97%。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的準確性和可靠性，又考慮到實際操作的便利，將最優(yōu)條件修正為:反應(yīng)溫度為42℃，反應(yīng)時間為49min，pH 為8.8，在修正后的優(yōu)化反應(yīng)條件下，酪蛋白的琥珀酰化程度為86.01% ±0.33%。
2.3 牦牛乳酰化酪蛋白乳化性分析
牦牛乳酪蛋白在琥珀?；揎椙昂蟮娜榛匦砸姳?。
表4 牦牛乳酪蛋白及琥珀?；业鞍兹榛€(wěn)定性和乳化活性Table 4 EAI and ESI values of modified yak caseins and unmodified yak casein
由表4 可以看出，琥珀?；揎楋@著改善了牦牛乳酪蛋白的乳化特性(p ＜0.01)。與未?；业鞍紫啾龋；业鞍兹榛€(wěn)定性增加了161.64%，乳化活性增加了98.54%。眾所周知，蛋白質(zhì)的乳化性與其結(jié)構(gòu)密不可分，其親水區(qū)域與水相互作用，疏水區(qū)域與油相互作用，從而體現(xiàn)出一定的乳化特性。琥珀?；揎楋@著增加了酪蛋白的凈負電荷，使得膠束結(jié)構(gòu)伸展［8］。牛乳酪蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，其單體肽鏈疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域完全分離，分子本身具有一定的疏水性［18-19］。在琥珀?；揎椬饔孟?，游離氨基形成了親水性更強的琥珀酰胺基，使得酪蛋白肽鏈的親水性區(qū)域的親水性增強，從而減緩了乳濁液中油水兩相的分離、聚集和分層的速率。因此，琥珀?；揎楋@著改善了酪蛋白的乳化性。
3 結(jié)論
對牦牛乳酪蛋白進行了琥珀?；揎棧捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化了?；に?，得出最佳反應(yīng)條件為溫度42℃，反應(yīng)時間49min，pH8.8;在最優(yōu)條件下，牦牛乳酪蛋白的琥珀酰化程度約86.01%。酪蛋白琥珀?；磻?yīng)條件溫和，參數(shù)可調(diào)范圍較大，易于調(diào)節(jié)和控制，?；揎棾潭雀摺?/p>
琥珀?；揎椩黾恿死业鞍啄z束的凈負電荷，使其結(jié)構(gòu)伸展，親水性增強，乳化穩(wěn)定性和乳化活性顯著改善，分別提高了161.64%和98.54%。因此，修飾酪蛋白可作為性能優(yōu)良的乳化劑。然而，琥珀酸酐雖然毒性較低，但其并非食品添加劑，琥珀?；揎椑业鞍啄芊裼糜谑称饭I(yè)還需對其食用安全性進行評估。
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