郭鳳仙，黃小林，熊幼翎，陳 潔*

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

大豆分離蛋白(SPI)由于其優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能特性被作為功能性添加劑廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。但在貯藏及運(yùn)輸過(guò)程中，SPI的品質(zhì)會(huì)發(fā)生顯著的劣變，如其溶解度會(huì)大幅下降，從而影響最終食品品質(zhì)的穩(wěn)定性，這已經(jīng)成為目前困擾SPI整個(gè)行業(yè)的難題。針對(duì)這一難題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了一定的研究。這些研究主要集中在影響SPI貯藏穩(wěn)定性的環(huán)境因素上，如高溫高濕、高氧氣[1-3]及微量油脂的氧化[4]都被報(bào)道不利于蛋白的貯藏穩(wěn)定性。但對(duì)于貯藏過(guò)程中SPI其他功能特性的變化，如乳化性、凝膠性，目前研究很少。同時(shí)，李祖胤等[4]的研究也表明在貯藏過(guò)程中SPI的氧化程度伴隨其溶解度的下降而升高。而吳偉[5]、黃友如[6]等研究表明微量的油脂氧化以及脂肪氧合酶的作用都可以導(dǎo)致大豆蛋白穩(wěn)定性的下降。此外，還有研究表明在干燥前向SPI中添加抗氧化劑(BHA、TBHQ)能夠顯著提高蛋白的初始溶解度[7]。這說(shuō)明SPI的貯藏穩(wěn)定性的下降與蛋白氧化有一定關(guān)系。所以，本實(shí)驗(yàn)主要探討SPI貯藏后的功能特性的變化，以及添加一些國(guó)標(biāo)允許使用的天然抗氧化劑(β-胡蘿卜素和生育酚)對(duì)SPI的氧化及功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂大豆粕 秦皇島益海嘉里糧油食品有限公司。

生育酚、β-胡蘿卜素、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) 美國(guó)Sigma公司；金龍魚(yú)大豆油(食用級(jí)) 上海嘉里糧油工業(yè)有限公司；其他分析試劑均為分析純 上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；T18 basic高速乳化均質(zhì)機(jī) 英國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備及貯藏

大豆分離蛋白的制備以低溫脫脂豆粕為原料，提取方法參考文獻(xiàn)[8]，使用堿溶酸沉的方法提取。酸沉后復(fù)溶到中性(pH 7.0)的SPI用去離子水稀釋到10g/100mL。分別將生育酚和β-胡蘿卜素(0.03g/100g pro，以干基計(jì))用熱水(50℃)分散均勻，然后全部轉(zhuǎn)移到大豆蛋白溶液中，室溫下攪拌30min，過(guò)均質(zhì)機(jī)，然后噴霧干燥。分別得到原始的空白SPI(NP)、添加β-胡蘿卜素的SPI(β-CT)以及添加生育酚的SPI(TOC)。微量凱式定氮測(cè)得的大豆蛋白產(chǎn)品純度為92.6%(m/m，以干基計(jì))。將上述制備的4種SPI樣品真空塑封后在37℃條件下貯藏12周。

1.3.2 羰基含量

羰基含量的測(cè)定采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法[9]。將SPI粉溶解在去離子水中，室溫下攪拌1h，然后10000×g離心15min，取上清液用去離子水稀釋到1g/100mL，然后參考文獻(xiàn)[9]中的方法測(cè)定。

1.3.3 總巰基含量

總巰基的測(cè)定使用Ellman試劑法[10]測(cè)定。將SPI粉溶解在去離子水中，室溫下攪拌1h，然后10000×g離心15min，取上清液用去離子水稀釋到1g/100mL，然后參考文獻(xiàn)[10]中的方法測(cè)定。

1.3.4 溶解性測(cè)定

將固體SPI分散在去離子水中(2g/100mL)，室溫下攪拌1h使樣品溶解，靜置2min后，將上層液倒入離心管中10000×g離心15min。取上清液10mL，采用凱式定氮測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 乳化性測(cè)定

[11]的實(shí)驗(yàn)方法， 配成蛋白濃度1g/100mL的溶液，取15mL蛋白溶液與5mL大豆油混合，放入100mL玻璃大試管中。在高速乳化均質(zhì)機(jī)下13500r/min乳化2min，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開(kāi)始取樣。取樣點(diǎn)固定在離燒杯底部0.5cm處，取20μL的乳狀液與5mL 0.1%的SDS溶液均勻混合，在波長(zhǎng)500nm處測(cè)定其吸光度，記為A0，乳狀液靜置30min后采用相同的方法測(cè)定乳狀液吸光度，記為A30，用0.1%的SDS溶液做空白對(duì)照。

式中：T為系數(shù)，本實(shí)驗(yàn)取2.303；N為稀釋倍數(shù)250；c為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)(0.25)。

1.3.6 凝膠性測(cè)定

將12g/100mL的SPI水分散液在室溫下攪拌2h，使其均勻分散。將攪拌均勻的大豆蛋白分散液離心(1700r/min，5min)除去氣泡，然后轉(zhuǎn)移到50mL小燒杯中，保鮮膜封口，置于90℃恒溫水浴加熱30min，取出后冰浴冷卻。

凝膠強(qiáng)度的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]，略有改動(dòng)。將制備好的凝膠在4℃冷室中過(guò)夜，取出后室溫下平衡30min，用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其凝膠強(qiáng)度。主要參數(shù)為：探頭類(lèi)型為P/0.5，測(cè)前速度1mm/s，測(cè)試速率1mm/s，測(cè)后速率10mm/s，穿刺距離4mm，觸發(fā)類(lèi)型為自動(dòng)，觸發(fā)力為5g。凝膠強(qiáng)度用硬度(hardness)，即探頭下壓過(guò)程中的最大感應(yīng)力(單位g)表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)中的顯著性分析(P＜0.05)采用LSD測(cè)試(SPSS Statistical Software，美國(guó))，顯著性分析中每個(gè)指標(biāo)中的所有數(shù)據(jù)均為同組分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過(guò)程中不同添加劑對(duì)SPI氧化的影響

2.1.1 羰基含量

蛋白羰基的產(chǎn)生主要是在氧氣、油脂及金屬離子(Fe3+)的存在下，發(fā)生自由基傳遞反應(yīng)，一般參與反應(yīng)的有N末端的α-氨基、脯氨酸、精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈以及半胱氨酸[13]。羰基含量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的氧化程度的重要指標(biāo)之一。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定蛋白在貯藏前后羰基含量的變化來(lái)研究不同的天然抗氧化劑對(duì)SPI氧化的抑制效果。如圖1所示，對(duì)照SPI (NP)在貯藏12周后，其羰基含量提高了80%，這說(shuō)明SPI在貯藏過(guò)程中發(fā)生了顯著氧化，添加生育酚(TOC)對(duì)羰基的增加沒(méi)有顯著的抑制效果，而添加β-胡蘿卜素(β-CT)的SPI在貯藏12周后顯著抑制了羰基含量的上升，其羰基含量較對(duì)照組(NP)下降了34%。β-胡蘿卜素理論上能夠抑制由單線(xiàn)態(tài)氧引發(fā)的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，添加β-胡蘿卜素的SPI在12周貯藏過(guò)程中羰基水平幾乎沒(méi)有上升，而具有抑制自由基反應(yīng)的生育酚對(duì)抑制SPI羰基含量的上升效應(yīng)不夠顯著，暗示SPI在貯藏過(guò)程中羰基上升可能與單線(xiàn)態(tài)氧誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)有關(guān)。

圖 1 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周羰基含量的變化Fig.1 Carbonyl group content changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

2.1.2 總巰基含量

圖 2 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周總巰基含量的變化Fig.2 Total sulfhydryl group changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

如圖2所示，添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI 樣品在貯藏初期的巰基含量都要顯著高于對(duì)照組，特別是添加生育酚的SPI其初始巰基含量較對(duì)照組提高了20%。由于抗氧化劑均在噴霧干燥前添加，所以這一結(jié)果說(shuō)明SPI中的巰基在噴霧干燥過(guò)程中存在氧化問(wèn)題，抗氧化劑的添加一定程度上能夠抑制噴霧干燥引發(fā)的氧化。貯藏12周后， SPI樣品的巰基含量均顯著下降，添加兩種添加劑的SPI總巰基含量都顯著高于對(duì)照組。總巰基含量的下降可能的原因是在蛋白氧化過(guò)程中氧化成為二硫鍵或一系列酸性含硫酸基[13]。圖2結(jié)果說(shuō)明，各類(lèi)抗氧化劑對(duì)于SPI貯藏過(guò)程總巰基的變動(dòng)也有一定抑制效應(yīng)。

2.2 貯藏過(guò)程中不同添加劑對(duì)SPI功能特性的影響

2.2.1 溶解性

圖 3 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周溶解度的變化Fig.3 Solubility changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

良好的溶解性是蛋白質(zhì)發(fā)揮其他功能特性的前提。添加不同抗氧化劑對(duì)SPI貯藏前后溶解度的影響如圖3所示?？傮w而言，添加抗氧化劑對(duì)于SPI的初始溶解度影響不顯著，而貯藏12周后，添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI溶解度顯著高于對(duì)照組樣品。

2.2.2 乳化性

圖 4 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化Fig.4 Changes in emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

不同SPI乳化性在貯藏12周前后的變化如圖4所示。添加不同抗氧化劑的SPI初始乳化性與對(duì)照相比(圖4A)均略有下降。而貯藏12周后，各SPI樣品的乳化性都有顯著下降，但添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI乳化性下降幅度顯著小于對(duì)照組。相比乳化性，抗氧化劑的添加對(duì)乳化穩(wěn)定性(圖4B)的影響非常劇烈?？寡趸瘎┑母鱏PI其初始乳化穩(wěn)定性與對(duì)照相比都顯著降低。在貯藏12周后，對(duì)照SPI的乳化穩(wěn)定性下降了一半以上，而添加β-胡蘿卜素的SPI乳化穩(wěn)定性反而分別比貯藏初期上升了49%和69%。從羰基(圖1)及巰基(圖2)測(cè)定結(jié)果推測(cè)，在溶解度(圖3)差別不大的條件下，乳化穩(wěn)定性的改善與羰基值關(guān)聯(lián)度較小，但與總巰基的變動(dòng)趨勢(shì)很接近，說(shuō)明二硫鍵大量被還原是不利于乳化穩(wěn)定性的，而巰基的輕度氧化交聯(lián)有可能有利于乳化穩(wěn)定性，但巰基的重度氧化交聯(lián)可能不利于乳化穩(wěn)定性。有研究表明[14]肌肉蛋白的氧化對(duì)蛋白乳化穩(wěn)定性有損傷作用。

2.2.3 凝膠強(qiáng)度

添加不同抗氧化劑的SPI對(duì)其凝膠強(qiáng)度有輕微的破壞作用。如圖5所示，在貯藏初期，添加抗氧化劑的SPI凝膠強(qiáng)度均低于對(duì)照組，特別是添加β-胡蘿卜素的SPI凝膠強(qiáng)度較對(duì)照下降了26%。但在貯藏12周后，雖然蛋白的溶解度都有不同程度的顯著下降，但各組SPI的凝膠強(qiáng)度均較貯藏前有大幅度升高，其中對(duì)照組升高幅度最大。這可能與SPI在貯藏過(guò)程中發(fā)生氧化有關(guān)，巰基交聯(lián)或者羰基升高暗示的氧化交聯(lián)可能有助于SPI凝膠強(qiáng)度的提高。有研究表明大豆蛋白和肌原纖維蛋白經(jīng)輕微氧化后其凝膠強(qiáng)度得到提高[14-15]。但各SPI的氧化程度與凝膠強(qiáng)度對(duì)應(yīng)性不強(qiáng)，這說(shuō)明除了氧化以外，SPI貯藏后凝膠強(qiáng)度升高可能還有其他影響因素。

圖 5 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周凝膠強(qiáng)度的變化Fig.5 Gel strength changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

3 結(jié) 論

未添加抗氧化劑的SPI經(jīng)12周貯藏后蛋白氧化顯著，羰基含量顯著升高和總巰基含量顯著下降，同時(shí)，其溶解性及乳化活性都大大降低，但凝膠強(qiáng)度卻顯著上升(P＜0.05)。天然抗氧化劑β-胡蘿卜素和生育酚的添加都顯著抑制了長(zhǎng)期貯藏造成的SPI中蛋白質(zhì)的氧化(羰基含量的上升和巰基含量的下降)、SPI的溶解性及乳化性的下降(P＜0.05)，同時(shí)也部分抑制了貯藏后SPI凝膠強(qiáng)度的提高。

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