趙方圓，吳亞君，韓建勛，陳 穎,*，葛毅強*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045)

蜂王漿(royal jelly，RJ)是由哺育蜂頭部咽下腺和上鄂腺共同分泌的具有酸、澀、辣、甜并略帶特殊芳香氣味的乳白色或淡黃色的漿狀物，它在蜜蜂的等級分化中發(fā)揮著重要的作用[1]。對于人類，蜂王漿具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗氧化抗菌等多種生理藥理功能[2-5]，除了10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA)，蜂王漿蛋白在其中也發(fā)揮著極其重要的作用[6-7]。2006年西方蜜蜂基因組聯(lián)盟完成了其全基因組測序和序列分析，王漿主蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)基因序列、蛋白功能已得到解析，使MRJPs成為近年來研究非常熱門的營養(yǎng)蛋白[8]，基于雙向電泳技術(shù)的蜂王漿蛋白質(zhì)組學的研究國內(nèi)外已有相關(guān)報道[9-13]。Sano等[9]利用雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術(shù)研究了非洲蜜蜂及歐洲蜜蜂(意大利蜜蜂)所產(chǎn)蜂王漿的特性。Schonleben等[10]利用一維電泳、二維電泳及多維液相色譜一共鑒定出蜂王漿中含有20種不同的蛋白。國內(nèi)李建科等[14]利用雙向電泳、質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學研究方法對蜂王漿新鮮度、不同種蜜蜂產(chǎn)的蜂王漿蛋白質(zhì)組[13]進行了研究。

2-DE是研究蛋白質(zhì)組的重要技術(shù)之一，它的原理是首先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同采用等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)分離蛋白質(zhì)，然后再按蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的不同利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將復雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。蛋白質(zhì)組學技術(shù)作為前沿技術(shù)，在食品蛋白質(zhì)研究中也得到越來越廣泛的應(yīng)用[15-18]。然而由于涉及的人工操作步驟多，實驗周期長，即使是同一實驗材料，采用不同的處理方法也會得到不同質(zhì)量的實驗結(jié)果。研究目的不同、樣品不同，采用的雙向電泳的規(guī)格與條件也不盡相同，主要表現(xiàn)在蛋白上樣量的不同、膠條pH值范圍的不同、聚焦條件的不同等方面。如蜂王漿的雙向電泳研究大多采用pH 3～10的固相pH值梯度(immobilized pH gradient，IPG)膠條進行IEF[9-10]，但Furusawa等[11]采用pH 4～7的IPG膠條對蜂王漿蛋白質(zhì)組有較好的分離。這說明了針對不同的蜂王漿樣品，需要進行雙向電泳條件的優(yōu)化，從而獲得最佳的分離效果。

中國是世界上蜂王漿生產(chǎn)量最大的國家[19]，蜂王漿質(zhì)量問題己成為近年來蜂王漿產(chǎn)業(yè)關(guān)注的焦點，而蜂王漿中的蛋白質(zhì)含量豐富，其種類及含量的變化都將引起蜂王漿質(zhì)量的變化。前人[10-11]對蜂王漿蛋白質(zhì)組的研究大都利用17cm或24cm規(guī)格的大型雙向電泳凝膠，以達到對蜂王漿蛋白更全面的研究。但是大型膠電泳耗時長，實驗難度大，所需要的試劑、儀器價格也相應(yīng)提高。本研究的最終目的是將雙向電泳技術(shù)作為一種檢測手段來檢測蜂王漿中蛋白的變化，為了縮短檢測時間并降低操作難度，使該方法更加可行，采用了11cm的中型雙向電泳凝膠，因而在IPG膠條的選擇、上樣量、聚焦時間及垂直膠濃度上都與大型膠有所不同。本研究的樣品將選擇具有代表性的蜂王漿樣品，擬從第一向IPG膠條的選擇、蛋白質(zhì)上樣量、聚焦時間和第二向膠濃度的選擇等方面對蜂王漿蛋白質(zhì)的雙向電泳條件進行優(yōu)化，建立適合大多數(shù)蜂王漿樣品的雙向電泳技術(shù)體系，以期為進一步研究蜂王漿蛋白質(zhì)組提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

蜂王漿樣品由中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所實驗蜂場提供，為2011年5月采集的由意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)生產(chǎn)的油菜漿。蜂王漿從臺基中取出立即裝入無菌Eppendorf管中，并冷藏于－80℃。

1.1.2 試劑

N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、礦物油、低熔點瓊脂糖封膠液、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(1,4-dithiothreitol，DTT)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、考馬斯亮藍染色液(CBB)G-250 美國Bio-Rad公司；硫脲 美國Sigma公司；尿素 美國Promega公司；過硫氨酸 國藥集團化學試劑有限公司；SDS 美國Amresco公司；甘氨酸 美國 Novon公司。

裂解緩沖液：8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4% CHAPS、20mmol/L Tris-base、30mmol/L DTT、2% Bio-Lyte)；水化上樣緩沖液：8mol/L尿素、4% CHAPS、50mmol/L DTT、0.2% Bio-Lyte、0.001%溴酚藍；SDS-PAGE：丙烯酰胺膠濃度分別為8%、10%、12%；膠條平衡緩沖液Ⅰ：6mol/L尿素、2% SDS、0.375mol/L Tris-HCl、20%甘油、2% DDT；膠條平衡緩沖液Ⅱ：6mol/L尿素、2% SDS、0.375mol/L Tris-HCl、20%甘油、2.5%碘乙酰胺；10×電泳緩沖液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1% SDS，pH 8.3；固定液(甲醇、乙酸、水體積比5：1：4)均為本實驗室配制；pH 3～10、pH5～8、pH 4～7 IPG預(yù)制膠條及對應(yīng)兩向電解質(zhì)(pH 3～10、pH 5～8、pH4～7)、30%的丙烯酰胺溶液、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PROTEAN IEF Cell水平電泳系統(tǒng)、Criterion中型垂直電泳槽、Versa-Doc MP 4000 Imaging System成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白的提取及蛋白的定量

蛋白提取方法根據(jù)Li Jianke等[14]報道的方法稍做改良，將100mg的蜂王漿和1mL的裂解緩沖液充分混合，4℃、15000×g離心10min。取上清液并分裝于1.5mL離心管，每管100μL，然后加入3～5倍體積的丙酮(預(yù)先放置于－20℃)，冰浴30min后8000×g離心10min，去上清。待丙酮完全揮發(fā)后，沉淀用100μL的裂解緩沖液再次溶解。所得蛋白樣品均采用Bradford法[20]進行濃度測定。

1.2.2 等電聚焦電泳

采用PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)，11cm IPG預(yù)制膠條選擇pH 3～10、5～8、4～7范圍的膠條進行優(yōu)化，每根膠條加350μL水化上樣緩沖液，蛋白質(zhì)上樣量根據(jù)實驗設(shè)計分別調(diào)整為50、150、250μg，聚焦溫度為20℃，每根膠條的限制電流為50μA，等電聚焦設(shè)置參數(shù)如表1所示。

表 1 等電聚焦參數(shù)的設(shè)定Table 1 Parameter setting of IEF

1.2.3 垂直電泳

將等電聚焦的膠條先后放在膠條平衡緩沖液Ⅰ和膠條平衡緩沖液Ⅱ中各平衡15min，根據(jù)實驗設(shè)計，采用聚丙烯酰胺膠濃度分別為8%、10%、12%的均一膠進行第二向電泳，將融化的瓊脂糖封膠液置于第二向膠上，約1cm高。取平衡好的IPG膠條，先在電泳緩沖液中進行快速沖洗，然后放在第二向膠上。在18℃的恒溫條件下進行電泳，起始電流15mA，待蛋白從IPG膠條進入第二向膠后，恒流30mA條件下進行電泳3～4 h。每個實驗條件做3次重復。

1.2.4 染色和圖像掃描分析

電泳結(jié)束后用固定液固定30min，CBB G-250染色1h，去離子水脫色直至背景為無色透明，蛋白質(zhì)點清晰為止。脫色后凝膠使用凝膠成像儀透射模式進行掃描成像，所得圖像使用 PDQuest V 7.3.0(Bio-Rad)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPG預(yù)制膠條的選擇

在進行不同pH值范圍的IPG膠條選擇時主要考慮樣品中蛋白質(zhì)的主要分布情況。本實驗采用pH 3～10、4～7、5～8的IPG膠條對蜂王漿蛋白樣品分別進行雙向電泳，結(jié)果如圖1所示，當采用pH值范圍為pH3～10的IPG膠條時，蛋白點較緊密地分布在凝膠的中間區(qū)域(如圖1A圓圈中所示)，經(jīng)PDQuest軟件分析，共檢測到42個蛋白點，由于蛋白點分布過于密集導致部分蛋白相互疊加覆蓋，不利于后續(xù)的蛋白質(zhì)點的切膠酶解及質(zhì)譜鑒定。當采用pH 4～7的IPG膠條進行實驗時，在凝膠中只檢測到25個蛋白點，說明蜂王漿中有一部分蛋白并不分布在此pH值范圍內(nèi)，大量偏堿性蛋白丟失(如圖1B圓圈中所示)。利用pH 5～8的IPG膠條獲得的圖譜其蛋白點數(shù)最多(66個)且蛋白分離效果明顯，蛋白點清晰，因此，進行蜂王漿蛋白的雙向電泳實驗選擇pH 5～8的IPG膠條，電泳效果最好。

圖 1 不同pH值范圍的IPG膠條的雙向電泳圖譜比較Fig.1 Comparison of 2-DE images with IPG strip at different pH ranges

2.2 蛋白質(zhì)上樣量的優(yōu)化

選擇合適的上樣量對獲得高質(zhì)量的雙向凝膠電泳圖譜至關(guān)重要。蛋白上樣量過低不利于低豐度蛋白的檢出，上樣量過高則會造成高豐度蛋白濃度過大從而連成一片，分辨率降低。蛋白質(zhì)上樣量的確定與IPG膠條的長度、pH值范圍、聚焦時間的長短及蛋白質(zhì)的染色方法密切相關(guān)。本實驗選擇11cm的pH5～8的IPG膠條，考馬斯亮藍G-250進行染色，上樣量相對需要較大，如圖2所示，當上樣量為500μg時，通過PDQuest分析，只有16個蛋白點較清晰，其余較低豐度蛋白都模糊不清甚至丟失。當上樣量為為250μg時，檢測到71個蛋白點，蛋白點較多，但高豐度蛋白點過大，出現(xiàn)過飽和重疊現(xiàn)象，還有可能會掩蓋周圍低豐度蛋白點，且圖譜上橫條紋比較明顯，會影響到后續(xù)蛋白質(zhì)點的分離與分析。蛋白質(zhì)上樣量為150μg時，蛋白點清晰，可在凝膠上檢測到66個點，聚焦效果好，分辨率高，圖譜的質(zhì)量最佳。

圖 2 不同上樣量的雙向電泳圖譜比較Fig.2 Comparison of 2-DE images with different protein loading amounts

2.3 聚焦時間的優(yōu)化

為了得到理想的2-DE圖譜，本研究對等電聚焦電泳的聚焦時間進行了優(yōu)化。聚焦時間同膠條的長度、pH值梯度、兩性電解質(zhì)以及蛋白上樣量有關(guān)，聚焦時間不足容易造成高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)聚焦不完全、蛋白點不圓等問題[19]。聚焦時間過長則有可能由于蛋白質(zhì)在其等電點位置時不穩(wěn)定而造成橫向拖尾。本實驗將聚焦時間分別設(shè)定為24000、32000、40000V·h，不同聚焦時間下得到的2-DE圖譜有明顯的區(qū)別。當聚集時間為24000V·h時，發(fā)現(xiàn)凝膠右側(cè)偏堿性端蛋白點不圓(圖3A圓圈中所示)，說明聚焦不充分；在32000V·h聚焦時在凝膠上顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)點多且清晰，PDQuest軟件分析檢測到蛋白點數(shù)為66個；而當聚焦時間為40000V·h時，凝膠堿性端蛋白連成橫線嚴重且分辨率相對較差(圖3C圓圈中所示)，說明聚焦時間過長。以上表明，蜂王漿蛋白在聚焦達到32000V·h的情況下能充分地聚焦，得到較為理想的圖譜。

圖 3 不同聚焦時間的雙向電泳圖譜比較 Fig.3 Comparison of 2-DE images with different focusing time of IEF

2.4 垂直電泳丙烯酰胺膠濃度的優(yōu)化

第二向分離膠的丙烯酰胺膠濃度會影響蛋白質(zhì)的分離效果，本實驗探討了8%、10%和12%的分離膠對蜂王漿蛋白質(zhì)的分離效果。由圖4可知，大多數(shù)蛋白點雖然能在8%的分離膠中充分分開，但蛋白點的分離效果不理想，且分子質(zhì)量30kD以下的蛋白點(如圖4B和圖4C中方框標記)丟失。在12%的分離膠中，分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)重疊嚴重(如圖4C中圓圈所示)，不能完全分開，而且蛋白前沿離分離膠底端還有一段較長的距離，說明膠濃度太大。10%的分離膠不但可以充分分離分子質(zhì)量大的蛋白，分子質(zhì)量小的蛋白也不至丟失。根據(jù)以上結(jié)果認為，本實驗中分離蜂王漿蛋白質(zhì)的第二向分離膠最適丙烯酰胺膠濃度為10%。

圖 4 不同丙烯酰胺膠濃度SDS-PAGE的雙向電泳圖譜的比較Fig.4 Comparison of 2-DE images with different separating gel concentrations

3 討 論

本研究所采用的蜂王漿為意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)生產(chǎn)的油菜漿，意大利蜜蜂自上個世紀30年代引入中國后，經(jīng)過半個世紀的發(fā)展成為中國生產(chǎn)蜂王漿的高產(chǎn)蜂種，年產(chǎn)蜂王漿2000t以上，大約占全世界蜂王漿總量的90%以上[19]。而早春油菜花期，由于氣候適宜，蜜源豐富，蜂群處于繁殖期，適齡工蜂數(shù)量多，泌漿積極性高，生產(chǎn)的蜂王漿質(zhì)量是全年中最佳的，產(chǎn)量也比較可觀[21]。Furusawa等[11]曾研究過分別在兩個不同開花時期采集的不同蜜源的蜂王漿的蛋白質(zhì)組，并得出結(jié)論：蜂王漿中的蛋白組成是穩(wěn)定的，不會因蜜源的不同產(chǎn)生較大差異。因而本研究的結(jié)果也適用于其他蜜源生產(chǎn)的蜂王漿。

前人的研究[9-13]大多以尋找蜂王漿中未知蛋白或?qū)Ρ炔煌浞N產(chǎn)蜂王漿蛋白組差異為目的，因而需要利用可以展現(xiàn)更多蛋白點的大型膠。Li Jianke等[14]利用17cm的雙向電泳凝膠來研究蜂王漿蛋白質(zhì)組，選擇pH3～10的IPG膠條，上樣量為200μg，聚焦時間為60000V·h，垂直膠濃度為12%，檢測到的蛋白點數(shù)最多為62個。而Furusawa等[11]采用24cm的雙向電泳凝膠來研究蜂王漿中蛋白，選取pH4～7的IPG膠條，上樣量為100μg，聚焦時間為76908V·h，垂直膠采用梯度膠，膠濃度為12%～14%，可檢測到105個蛋白點。本研究目的在于檢測蜂王漿中已知蛋白的變化以推測蜂王漿的質(zhì)量，從提高效率，簡化實驗，節(jié)省時間和成本等方面考慮，采用了11cm的中型雙向電泳凝膠，因而在IPG膠條的選擇、上樣量、聚焦時間及垂直膠濃度上都與大型膠有所不同。綜合各步驟不同條件下的實驗結(jié)果，從蛋白點的分離效果、蛋白點的數(shù)量、分辨率等幾個方面綜合考慮，對于11cm的蜂王漿雙向電泳的最適條件為采用pH5～8的 IPG膠條，150μg的上樣量，聚焦時間32000V·h，垂直膠丙烯酰胺濃度為10%，在此條件下，本實驗對從蛋白提取到雙向電泳的整個過程進行了3次重復，所得的雙向電泳圖譜具有較好的重復性，可檢測到62±4個蛋白點，初步滿足了雙向電泳技術(shù)作為一種檢測手段來檢測蜂王漿蛋白質(zhì)的條件，也為有效地監(jiān)控蜂王漿質(zhì)量并進一步規(guī)范蜂王漿市場提供了參考。

[1] KNECHT D, KAATZ H H. Patterns of larval food production by hypopharyngeal glands in adult worker honeybees[J]. Apidologie, 1990, 21： 457-468.

[2] BILIKOVA K, WU G S, SIMUTH J. Isolation of a peptide fraction from honeybee royal jelly as a potential antifoulbrood factor[J]. Apidologie, 2001, 32(3)： 275-283.

[3] LI Jianke, CHEN Shenglu. Royal jelly and human health[J]. Am Bee J, 2003, 143(5)： 398-402.

[4] TOKUNAGA K H, YOSHIDA C, SUZUKI K M, et al. Antihypertensive efect of peptides from royal jelly in spontaneously hypertensive rats[J]. Biol Pharm Bull, 2004, 27(2)： 189-192.

[5] OKA H, EMORI Y, KOBAYASHI N, et al. Suppression of allergic reactions by royal jelly in association with the restoration of macrophage function and the improvement of Th1/Th2 cell responses[J]. Int Immunopharmacol, 2001, 1(3)： 521-532.

[6] FUJII M, YONEKURA M, HIGUCHI T, et al. Effect of 350 kDa glycoprotein in royal jelly onprimary culture of rat hepatocytes[J]. Food Sci Technol Int, 1996, 2： 223-225.

[7] OKAMOTO I, TANIGUCH Y, KUNIKATE T, et al. Major royal jelly protein 3 modulates immune responses in vitro and in vivo[J]. Life Sci, 2003, 73： 2029-2045.

[8] DRAPEAU M D, ALBERT S, KUEHARSKI R, et al. Evolution of the yellow/major royal jelly protein family and the emergence of social behavior in honey bees[J]. Genome Res, 2006, 16： 1385-1394.

[9] SANO O, KUNIKATE T, KOHNO K, et al. Characterization of royal jelly proteins in both Africanized and European honeybees (Apis mellifera) by two-dimensional gel electrophoresis[J]. J Agric Food Chem, 2004, 52： 15-20.

[10] SCHONLEBEN S, SICKMANN A, MUELLER M J, et al. Proteome analysis of Apis mellifera royal jelly[J]. Anal Bioanal Chem, 2007, 389(4)： 1087-1093.

[11] FURUSAWA T, RAKWAL R, NAM H W, et al. Comprehensive royal jelly (RJ) proteomics using one- and two-dimensional proteomics platforms reveals novel RJ proteins and potential phospho/glycoproteins[J]. J Proteome Res, 2008, 7(8)： 3194-3229.

[12] QU Ning, JIANG Jie, SUN Liangxian, et al. Proteomic characterization of royal jelly proteins in Chinese (Apis cerana cerana) and European (Apis mellifera) honeybees[J]. Biochemistry(Mosc), 2008, 73： 676-680.

[13] FANG Yu, FENG Mao, LI Jianke. Royal jelly proteome comparison between A. mellifera ligustica and A. cerana cerana[J]. J Proteome Res, 2010, 9(5)： 2207-2215.

[14] LI Jianke, FENG Mao, ZHANG Lan, et al. Proteomics analysis of major royal jelly protein changes under different storage conditions[J]. J Proteome Res, 2008, 7(8)： 3339-3353.

[15] HOLT D L, ZEECE M G. Two-dimensional electrophoresis of bovine milk proteins[J]. Journal of Dairy Science, 1988, 71： 2044-2050.

[16] KIM S, KWEON S M, KIM E A. Characterization of Rnase-like major storage protein from the ginseng root by proteomic approach[J]. Journal of Plant Physiology, 2004, 161(7)： 837-845.

[17] INGER V H, KJAERSGARD I V, JESSEN F J, et al. Proteome analysis elucidating post-mortem changes in cod(Gadus morhua)muscle proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(14)： 3985-3991.

[18] MARTINEZ I, SLIZYTE R, DAUKSAS E, et al. High resolution two-dimensional electrophoresis as a tool to differentiate wild from farmed cod(Gadus morhua) and to assess the protein composition of klipfi sh[J]. Food Chemistry, 2007, 102(2)： 504-510.

[19] LI Jianke, WANG Ting, ZHANG Zhaohui, et al. Proteomic analysis of royal jelly from three strains of western honeybees (Apis mellifera)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55： 8411-8422.

[20] 魏開華, 應(yīng)天翼. 蛋白質(zhì)組學實驗技術(shù)精編[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社, 2010： 29-31.

[21] 胡福良, 李英華, 朱威. 影響蜂王漿質(zhì)量的因素： 兼析春季油菜王漿質(zhì)優(yōu)的原因[J]. 蜜蜂雜志, 2004(6)： 28-29.