辛樹權，劉海音，沈 勇

（長春師范學院生命科學學院，吉林長春 130032）

隨著工業(yè)的發(fā)展，石油在給人們帶來巨大的經濟效益的同時，對環(huán)境造成了極大的威脅。由于油田采出液不僅含有石油，也含有高濃度的鹽分，因此，采油現(xiàn)場附近發(fā)生溢漏會使土壤受到油和鹽的雙重污染[1]。目前石油污染已成為全世界各國亟待解決的問題，研究人員都在積極尋找治理石油污染的有效途徑。利用物理或化學方法處理石油污染物可以得到較好的效果，但成本高及二次污染等問題使其應用受到了限制。作為一種環(huán)境友好替代技術，石油污染土壤的生物修復已受到更多相關領域研究者的重視[2]。微生物修復以其高效、經濟和無二次污染等諸多優(yōu)點而成為近些年來主要處理石油污染土壤的方法，但微生物修復仍然存在著一定的局限性，因此微生物修復技術還需更深入的研究[3-5]。

石油的主要組成部分是由碳氫化合物形成的烴類，約占石油組分的95%～99%，其中烴類化合物有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴，此外還有40多種微量的金屬元素，如鈉、鉀、鈣、鎂等，其中鈉約占75%[3-6]。本文的研究是關于以含有兩個苯環(huán)的多環(huán)芳烴萘為唯一碳源從被石油副產品污染的土壤中分離出的純菌株，在不同pH和不同鹽濃度下菌株的生長情況以及該菌對石油降解性能的研究，同時也為石油污染的微生物修復提供新的菌種資源和信息。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

長春二道區(qū)中國石油東環(huán)城路加油站附近被石油副產品污染的土壤。

1.1.2 主要試劑與儀器

萘（上海中國遠航試劑廠），恒LD4-2離心機，T6新悅-可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 萘降解菌株的分離和培養(yǎng)

使用以萘為惟一碳源(200mg·L-1)的無機鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.02g，NH4NO31.00g，KH2PO40.40g，Na2HPO4·3H2O 0.60g，MnSO4·H2O 0.02g，CaCl·2H2O 0.02g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g[5]，加蒸餾水定容至 1000 ml，萘200mg/L，pH值7.0。

萘用正己烷溶解配制成200 mg·L-1的萘試劑加入到培養(yǎng)基中。

1.2.2 分離篩選培養(yǎng)基

無機鹽固體培養(yǎng)基，無機鹽培養(yǎng)基中加入瓊脂20g。

1.3 土壤中萘降解菌株的分離

土壤用100目的篩子過濾，除去大的雜質顆粒，然后取1 g土壤制備成土壤溶液，靜止后取稀釋液0.1ml涂布于含萘的分離培養(yǎng)基上；封好涂布后的平板，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d～5 d；從平板中挑出生長好的典型菌落，在含萘固體培養(yǎng)基上反復劃線培養(yǎng)，直到得到形態(tài)一致的純化菌落。

1.4 不同因素對菌株生長及菌株降解石油效率的影響

1.4.1 菌懸液和石油原液的制備

菌懸液的制備：挑取降解菌株，接種在TSB液體培養(yǎng)基中，在30℃165r/min搖床振蕩培養(yǎng)1天離心后，制備成菌懸液備用。

石油原液的制備：取10ml石油原液，加入90ml的石油醚，在60℃~90℃的水浴鍋中加熱溶解，制備成10%的石油原液后待石油醚揮發(fā)盡后備用。

1.4.2 培養(yǎng)液中原油萃取的方法

將培養(yǎng)7天后的搖瓶培養(yǎng)液全部傾入250ml的分液漏斗中，加入適量石油醚，加蓋充分振蕩2min，期間要注意放氣，靜止分層后，棄去下層液體。用適量石油醚將搖瓶中剩余的石油充分溶解后也倒入分液漏斗中，加蓋充分振蕩，注意放氣。靜止待液體充分分層后，棄去下層液體。將上層石油醚萃取液經用塞少許脫脂棉，上面放2g無水硫酸鈉的漏斗過濾。濾液放入事先洗凈烘干至恒重稱量后的錐形瓶中。再用少許石油醚沖洗搖瓶，將液體倒入分液漏斗中，重復前面的操作，直到搖瓶中的石油被抽提干凈為止。然后將裝有抽提液的錐形瓶置于恒溫水浴鍋中在60℃左右的溫度下于通風櫥中蒸干石油醚溶劑，干燥至恒重后稱量[7-10]。

降解率計算式：

降解率=1-(W1-W2)/W0×100%，

W0為初始原油質量（g），W1為錐形瓶+樣品中殘油的質量（g），W2為錐形瓶的質量（g）。

1.4.3 菌液的OD600處的吸光度值測定

取培養(yǎng)7天后的培養(yǎng)液（搖均勻）于比色皿中置于分光光度計中測定OD600處的值。

1.4.4 不同pH值對菌株的生長及菌株降解石油效率的影響

在50ml錐形瓶中加入25ml的無機鹽培養(yǎng)基并調節(jié)pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0，然后分別在pH值不同的錐形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培養(yǎng)基中石油的終濃達到1%，接種制備好的菌懸液250ul，在30℃、165r/min搖床培養(yǎng)7天后，測菌液在OD600處的吸光度值，并用重量法測定石油的降解率。

1.4.5 不同鹽濃度對菌株的生長及菌株降解石油效率的影響

在50ml錐形瓶中加入25mlpH為7.0的無機鹽培養(yǎng)基，并分別加入2.5ml的1 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1、7 g·L-1的NaCl溶液，然后分別在鹽濃度不同的錐形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培養(yǎng)基中石油的終濃達到1%，接種制備好的菌懸液250ul，在30℃、165r/min搖床培養(yǎng)7天后，測菌液在OD600處的吸光度值，并用重量法測定石油的降解率。

2 結果與分析

2.1 分離篩選的萘降解菌菌落的形態(tài)特征

經富集、分離獲得能以萘作為唯一碳源和能源生長的一株菌株，觀察菌落的形態(tài)特征（圖1）。菌落呈淡黃色、圓形、光滑突起、飽滿、邊緣整齊的形態(tài)并且易挑取。

圖1 平析中耐鹽性菌落的形態(tài)的光學顯微鏡照片

2.2 不同因素對菌株生長及菌株降解石油效率的影響

2.2.1 pH值對菌株生長及對菌株降解石油效率的影響

pH值會影響降解酶的空間構象，pH值的變化對酶活性的揮發(fā)有一定的影響。pH值還能調節(jié)菌體細胞對培養(yǎng)基質的利用速度和細胞的狀態(tài)，從而改變菌體的生長速度和微生物細胞的代謝途徑。通常微生物只能在特定的PH值范圍內生長，該范圍的寬窄可在一定程度上反映微生物對環(huán)境適應能力的強弱[11]。

圖2 不同pH對菌株生長的影響

圖3 不同pH對菌株降解石油效率的影響

如圖2所示，pH值對菌株的生長具有顯著的影響。在pH值為5~7之間時，菌株的生長呈上升趨勢，并且pH為7時生長值達到最大，隨著pH值的繼續(xù)升高，菌株的生長狀況又有所下降。pH對菌株降解石油的效率也有很大的影響，如圖3所示，當pH值為7時，降解率可達21.79%，此后隨著pH值繼續(xù)升高，菌株的生長受到抑制，對石油的降解率也隨之下降。這說明中性環(huán)境更有利于萘降解菌的生長，能更有效地降解石油。

2.2.2 鹽濃度對菌株生長及對菌株降解石油效率的影響

鹽脅迫對菌體的的毒害作用包括兩個方面：其一是產生離子毒害，在菌體內積累Na+，其二是產生滲透脅迫，使質膜的跨膜片滲透壓降低而導致細胞膨壓的喪失[12]。菌體細胞主要通過學習Na+的外流、Na+在囊泡中的區(qū)隔化、增加質膜K+的吸收而限制Na+的吸收、調節(jié)相容性滲調劑和滲透保護劑的合成和積累，以及脅迫蛋白的表達對鹽脅迫產生應答[13-14]。

圖4 不同NaCl濃度對菌株生長的影響

圖5 不同NaCl濃度對菌株降解石油效率的影響

如圖4所示，菌株在NaCl質量濃度為3 g·L-1以下時生長良好，而大于此濃度時，菌體會因不同程度的失水，使生長菌株生長受到抑制。如圖5所示，當NaCl濃度為3g·L-1時，對石油的降解效率較高，可達15.98%。當NaCl質量濃度為7 g·L-1時，對石油的降解率僅為9.67%。這說明NaCl濃度對石油的降解率有直接影響，濃度高使石油降解菌的生長受到了抑制，也間接的使石油降解率下降。

3 結論與討論

從長春二道區(qū)中國石油東環(huán)城路加油站附近挖取的被石油副產品污染的土壤中分離篩選出的一株以萘為唯一碳源的萘降解菌，對菌落進行形態(tài)學觀察，觀察到菌落呈淡黃色、圓形、光滑突起、飽滿、邊緣整齊的形態(tài)。通過研究不同pH和不同濃度的NaCl溶液對該菌生長情況的影響以及該菌對石油降解效率的影響后得出，該菌對石油具有優(yōu)良的降解性，在溫度30℃、轉速165r/min、pH值為7、NaCl質量濃度3g·L-1條件下降解性能最佳。

選擇適度的石油降解耐鹽菌對于環(huán)境保護具有重要作用。由于在石油開采中，原油為一種混合物，本身就帶著一定的鹽份，不僅對管道造成不同程度的腐蝕，同時也對土壤造成了一定的鹽害。以前我們往往用物理的或化學的手段來對落地原油進行處理，但是在修復環(huán)境的同時也對環(huán)境造成了二次污染。生物處理法是近年來發(fā)展起來的處理石油污染比較好的一種方法，具有處理效果好、費用低、對環(huán)境污染小、無二次污染及應用范圍廣等優(yōu)點。而應用微生物來治理石油烴類物質的污染，較物理或化學方法成本較低，投資少，效率高，因此越來越受到普遍重視[15-16]。

我們選擇的耐鹽菌株添加到受污染的土壤中，可以提高原土壤中原油的降解速度，加大降解率。同時耐鹽菌還可以減輕植物鹽害，增大植物的生長量，間接地對環(huán)境起到修復作用。

[1]夏星暉，許喜琳.土壤石油烴類污染治理方法評述[J].環(huán)境保護科學，1995，21（1）：1-5.

[2]宋雪英,宋玉芳,孫鐵珩,等.石油污染土壤中芳烴組分的生物降解與微生物生長動態(tài)[J].環(huán)境科學,2004,25(3):115-119.

[3]屠明明.原油污染土壤降解細菌的分離鑒定與污染物的生物降解研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

[4]廖雪義，劉秀紅，余海忠.萘降解菌的分離與鑒定[J].襄樊學院化學工程與食品科學學院，2010，38（5）：2248-2249，2253.

[5]阮志勇.石油降解菌株的篩選、鑒定及其石油降解特性的初步研究[J].環(huán)境科學與技術,2007,30(9):11-13.

[6]唐玉斌，毛莉，呂錫武，等.一株蒽降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學與技術，2007，30（9）：11-13.

[7]周德慶，胡寶龍，祖若夫，等.微生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2009：128-131.

[8]楊旭，唐玉斌，陳艷芳，等.一株萘降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學與技術，2011，34（10）：43-47.

[9]杜軍，張旭，黃琦.可降解萘細菌的分離與生長特性分析[J].安徽農業(yè)科學，2009，37（35）:17320-17322.

[10]?；刍?石油降解細菌的降解能力以及降解相關酶活性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學,2010.

[11]ZhangXF,Oyaizu H.Studyon isolation,identification and characteristics ofpolycyclic aromatic hydrocarbons degradingbacteria[J].Shanghai Environmental Science,2003,22(8):544-547.(in Chinese).

[12]MarquezJ A,Pascual Ahuir A,Proft M,SerranoR.The Ssn6-Tup1 repressor complexofSaccharomyces cerevisiae is involved in the osmotic induction ofHOG-dependent and-independent genes[J].EMBO,1998,(9):2543-2553.

[13]Coossens A,Dever TE,Pascual Ahuir A,SerranoR.The protein kinase Ccnp mediates sodiumtoxicityin yeast[J].Biol Chem,2001,273(33):30753-30760.

[14]SerannoR,Mulet J M,Rios G,MarquezJ A,de Larrinoa I,Leube M,Mendizabal I,Pascual-Ahuir A,Proft M,Ros R,Montesinos C.Aglimpse ofthe mechanisms ofion homeostasis duringsalt stress[J].Experimental Botany,1999,50(special issue):1023-1036.

[15]李凱峰,溫青,夏淑梅.石油污染土壤的生物處理技術[J].應用科技,2002,29(10):62-64.

[16]李麗,張利平,張元亮.石油烴類化合物降解菌的研究概況[J].微生物學通報,2001,28(5):89-92.