朱 超 陳思禮

（中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074）

藻膽蛋白是藍藻中一種捕光色素蛋白，由藻膽色素（Phycobilin）與其相應的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價結合而成.藻藍蛋白只有在結合了色基的情況下才有光學活性，而色基連接到脫輔基蛋白半胱氨基酸上需要色素裂合酶的催化［1－3］.定點突變能夠通過改變特定的氨基酸獲得突變蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的結構與功能，從微觀水平上闡明正常狀態(tài)下基因的調(diào)控機理、疾病的病因和機理［4］.可以利用定點突變對合成藻膽蛋白基因進行改造，以便深入了解光合作用中各種藻膽蛋白捕獲和傳遞光能的精細機制［5］.藻藍蛋白不僅可作為熒光探針用于免疫檢測、熒光顯微術和流式細胞儀技術，作為光敏劑用于光動力治療癌癥等方面，還具有提高機體免疫力、抗氧化，防治腫瘤等多種生理活性［6－9］.

通過BLAST 軟件同源性分析，從集胞藻PCC 6803中發(fā)現(xiàn)與裂合酶編碼基因cpeS具有同源性的基因slr2049.本實驗利用定點突變技術構建slr2049的8個突變體，以研究這8個氨基酸位點對酶催化活性的影響，確定哪些氨基酸在slr2049 酶催化活性中起到關鍵作用，從而為slr2049結構和功能的研究提供相關信息.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

集胞藻PCC6803購自中國科學院水生所藻種庫，大腸桿菌E.coli，DH5α，BL21（DE3）菌株均為本實驗室保存，克隆載體pBluescipt II SK（＋），表達載體pCDFDuet－1 為本實驗室保存，表達載體pET－23a（＋）由華中師范大學生科院惠贈.限制性內(nèi)切酶Pst I、Sal I、EcoR I和Xho I，T4DNA 連接酶，DL2000，DL5000，TaKaRa MutanBEST Kit定點突變試劑盒均為TaKaRa產(chǎn)品.DL250 購于武漢力博瑞生物科技有限公司.DNA 回收試劑盒，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒均為Axygen 公司產(chǎn)品.Taq酶、蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品.親和層析介質(zhì)購自南京金斯瑞生物科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1slr2049、ho1、cpcB、pcyA4 個基因的PCR擴增 根據(jù)NCBI提供的基因序列，利用Primer premier 5軟件設計引物，并在上下游引物分別引入酶切位點（下劃線部分），分別由南京金斯瑞生物科技有限公司和擎科新業(yè)生物技術有限公司合成.

提取的集胞藻PCC6803 總DNA 為模板，利用上述引物進行Touch－down PCR 擴增4 個基因.slr2049、ho1 和cpcB的PCR擴增反應程序：94℃5 min；94℃1 min，55℃～52℃（每循環(huán)降0.5℃）1min，72℃2min循環(huán)10次；94℃1min，52℃1min，72℃2min循環(huán)20次；72℃10min.pcyA 的PCR 擴增程序：94℃5 min；94℃1 min，60℃～50℃（每循環(huán)降0.5℃）1 min，72℃2 min循環(huán)20次；94℃1min，50℃1min，72℃2min循環(huán)15次；72℃10min.

1.2.2 4個基因的克隆 4個PCR 目的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，連接pBluescript II SK（＋）載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，挑取菌落培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過菌落PCR、雙酶切重組質(zhì)粒鑒定，送南京金斯瑞測序驗證.

1.2.3slr2049突變體的構建 將slr2049 的蛋白序列與已經(jīng)報道的6種色素裂合酶蛋白序列進行比對，得到22 個相同的位點.以構建的克隆載體pBlue－slr2049野生型為模板，設計引物（下劃線是突變位點），使用定點突變試劑盒對8個位點進行點突變.操作過程參照試劑盒使用說明書.引物由擎科新業(yè)生物技術有限公司合成，測序驗證.

1.2.4 表達載體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA的構建、蛋白的表達及條件優(yōu)化EcoRⅠ與PstⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－cpcB和pCDFDuet－1原核表達載體，EcoRⅠ與SalⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－h(huán)o1 和pET－23a（＋）原核表達載體，回收片段、連接、轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞，分別用鏈霉素及氨芐青霉素抗性篩選，測序驗證.

PstⅠ和SalⅠ分別雙酶切克隆載體pBlueslr2049野生型、pBlue－slr2049突變體和重組子pCDF－cpcB，SalⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－pcyA和重組子pET－h(huán)o1，重復上述過程.

培養(yǎng)過夜的重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA分別以1∶50接種于含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度分別為（0.6mmol／L和0.8mmol／L）、28℃誘導表達10h；同時用未加IPTG的重組菌和含pCDFDuet－1及pET－23a（＋）空載體的BL21（DE3）菌為對照.離心收集細胞，含重組子的細胞重懸于超聲波緩沖液中（pH7.0），超聲6min，離心得到上清和沉淀，ddH2O稀 釋，加 上樣緩沖液、β－巰基乙醇煮沸6min，進行SDS－PAGE檢測.

1.2.5 重組藻藍蛋白β亞基的體內(nèi)合成及蛋白誘導 pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體分別和pET－h(huán)o1－pcyA共轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）的感受態(tài)細胞中，含有鏈霉素和氨芐青霉素的雙抗平板進行篩選，挑取菌落培養(yǎng)于含鏈霉素和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.

將培養(yǎng)過夜的共轉(zhuǎn)化重組菌以1∶50接種于含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度為1mmol／L）、20℃誘導表達12h；同時用未加IPTG的共轉(zhuǎn)化重組菌和含pCDFDute－1及pET－23a（＋）空載體的BL21（DE3）菌為對照.處理同上，進行SDS－PAGE檢測重組蛋白.

1.2.6 重組藻藍蛋白β亞基表達和純化 培養(yǎng)過夜的共轉(zhuǎn)化重組菌以1∶20接種于含雙抗的1.1L LB 培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度為1mmol／L）、20℃誘導表達12h；離心收集細胞，細胞重懸于LE buffer（50mmol NaH2PO4，300mmol NaCl，pH 8.0），超聲破碎40min，離心得到上清，參照親和層析說明書操作，得到的蛋白樣品用SDS－PAGE檢測.

1.2.7 光譜測定 吸收光譜用UW757CRT 型紫外可見分光光度計，紫外可見光譜掃描范圍300～800nm，掃描速度960nm／min，狹縫寬度1.0nm；熒光光譜用F－2500熒光光度計，熒光光譜掃描速度1500nm／min，狹縫寬度5.0nm.

2 實驗結果

2.1 slr2049、ho1、cpcB、pcyA4個基因的克隆與鑒定

以集胞藻Synechocystissp.PCC 6803基因組DNA 為模板，P1－P8引物分別擴增出基因slr2049、cpcB、ho1、pcyA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到4個條帶和NCBI上已知基因大小分別是579bp，519bp，723bp，747bp相符.回收擴增的產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒，采用菌落PCR 及限制性內(nèi)切酶雙酶切作進一步鑒定（圖1），通過測序證明得到了目的條帶.

圖1 4個基因的PCR 產(chǎn)物，pBlue－slr2049野生型、pBlue－cpcB、pBlue－pcyA、pBlue－h(huán)o1 雙酶切鑒定圖譜Fig.1 PCR products of the four genes and Enzymatic cleavage analysis of pBlue－slr2049、pBlue－cpcB、pBlue－pcyA、pBlue－h(huán)o1

2.2 slr2049突變體鑒定

以pBlue－slr2049野生型為模板，采用定點突變引物P9－P24擴增突變基因，挑取陽性克隆，進行菌落PCR，PstⅠ、SalⅠ雙酶切和測序鑒定，證明突變體構建成功（圖2）.

2.3 重組表達載體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA 構建與表達

重組質(zhì)粒pBlue－cpcB、pBlue－h(huán)o1經(jīng)雙酶切并回收基因后亞克隆到原核表達載體pCDFDuet－1、pET－23a（＋），構建重組表達質(zhì)粒pCDF－cpcB、pET－h(huán)o1.克隆質(zhì)粒pBlue－slr2049 野生型、pBlueslr2049突變體以及pBlue－pcyA 經(jīng)相應的限制性內(nèi)切酶雙酶切，重復上述操作.成功構建重組表達載 體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA.

圖2 8個slr2049突變體PCR 和pBlue－slr2049突變體雙酶切鑒定圖譜Fig.2 PCR products of the eight slr2049mutants and Enzymatic cleavage analysis of pBlue－slr2049mutants

圖3 表達載體雙酶切鑒定圖譜Fig.3 Enzymatic cleavage analysis of expression vector

重組表達質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049 野 生 型 和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA 轉(zhuǎn)化E.coli后，篩選陽性重組子，經(jīng)IPTG 誘導表達.SDS－PAGE 分析表達產(chǎn)物（圖4），可以看出，目的蛋白的大小與預期的蛋白分子量吻合.CpcB、Slr2049野生型、Slr2049突變體和PCB合成酶表達成功.

圖4 pCDF－cpcB－slr2049野生型和pET－h(huán)o1－pcyA 表達產(chǎn)物的SDS－PAGE電泳圖Fig.4 Analysis of expressed products of pCDF－cpcBslr2049and pET－h(huán)o1－pcyA SDS－PAGE

2.4 重組藻藍蛋白β亞基的體內(nèi)合成及蛋白誘導、純化和光譜分析

將重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體分別與pET－h(huán)o1－pcyA共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）后，篩選陽性重組子，經(jīng)IPTG 誘導表達，得到共轉(zhuǎn)化菌株，冷凍離心收集菌體后，發(fā)現(xiàn)含有野 生型重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049 和 突 變 體重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049（H21S）／slr2049（L23S）／slr2049（F25S）／slr2049（W72L）／slr2049（G84S）／slr2049（Y124）的菌體沉淀均呈藍綠色，而含有突變體重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049（A24S）／slr2049（R107S）的轉(zhuǎn)化菌體沉淀沒有藍綠色.鎳柱純化，SDS－PAGE檢測目的蛋白與預測大小一致（圖5）.

將純化的重組蛋白用紫外可見分光光度計和熒光光譜儀檢測吸收光譜.從吸收光譜和熒光光譜可知，野生型slr2049 和突變體slr2049（H21S）／slr2049（L23S）／slr2049（F25S）／slr2049（W72L）／slr2049（G84S）／slr2049（Y124S）能催化PCB 正確偶聯(lián)到CpcB上，產(chǎn)物的最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在623nm 和640nm 左右，與天然產(chǎn)物最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在625nm 和645nm 相近.而突變體slr2049（A24S）／slr2049（R107S）所催化的產(chǎn)物沒有出現(xiàn)最大吸收峰和熒光發(fā)射峰.突變體slr2049（L23S）／slr2049（W72L））／slr2049（G84S）所催化的產(chǎn)物雖然有吸收峰，但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049催化的產(chǎn)物的吸收峰值相比明顯要小很多.

圖5 SDS－PAGE檢測純化的pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049野生型和pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049突變體表達產(chǎn)物Fig.5 Examination of purified pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049and pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049mutants with SDS－PAGE

圖6 體內(nèi)合成的重組藻藍蛋白β亞基紫外吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of phycocyaninβ－subunit obtained by in vivo reconstitution

圖7 體內(nèi)合成的重組藻藍蛋白β亞基熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of phycocyaninβ－subunit obtained by in vivo reconstitution

3 討論

本實驗從構建突變體、表達載體、蛋白表達、SDS－PAGE凝膠電泳以及光譜掃描的結果，可以說明slr2049所編碼的蛋白具有色素裂合酶的功能，同時也了解了slr2049的結構特點，以及這些結構與蛋白slr2049 在功能上的關系.光譜圖上，野生型slr2049和突變體slr2049（H21S）、slr2049（L23S）、slr2049（A24S）、slr2049（F25S）、slr2049（W72L）、slr2049（G84S）、slr2049（R107S）、slr2049（Y124S）之間有光譜吸收峰值差異，說明這8個突變位點對催化生成藻藍蛋白β亞基的能力也是有差異的.第24、107位丙氨酸和精氨酸突變所催化的表達產(chǎn)物在光譜圖上無光譜特性，可知沒有藻藍蛋白β亞基生成；證明24、107位的丙氨酸和精氨酸是必需氨基酸，是色素裂合酶的酶活中心，這兩個氨基酸的突變可以使色素裂合酶失活，喪失催化能力.第21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸突變所催化的表達產(chǎn)物從光譜圖可知，它們有和野生型slr2049相差不大的吸收峰，說明有藻藍蛋白β亞基生成；證明21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸對色素裂合酶的催化作用無明顯影響，不是必需氨基酸.第23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸突變所催化的表達產(chǎn)物從光譜圖可知，它們雖然有吸收峰，但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049最大值相比明顯要小，說明有藻藍蛋白β亞基生成，但蛋白重組效率不高；證明23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的關鍵位點，這3個氨基酸的突變能影響它的活性，降低它的催化能力.造成這一差異可能原因是氨基酸的定點突變能造成蛋白的結構和溶解性改變，從而影響了蛋白的催化能力.而對于其余的高保守的氨基酸位點是否是該蛋白酶的必需氨基酸和酶活性中心或是催化關鍵位點，待在后續(xù)的實驗中進一步的研究.

藻膽蛋白的獲得主要通過從藻類中提取的途徑，若采用基因工程技術生產(chǎn)此種蛋白，必須先了解生成藻藍蛋白的機制，才能利用基因工程技術獲得大量藻膽蛋白，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效應.唐志紅等［10］、趙方慶等［11］在大腸桿菌中高效表達了藍藻別藻藍蛋白基因，并能大量生產(chǎn)高純度重組別藻藍蛋白——鐳普克（recombinantallophycocyanin，rAPC），試驗證明這一產(chǎn)物有良好的抗腫瘤活性和免疫能力.隨著藻藍蛋白機制的研究和基因工程技術的運用，藻膽蛋白在醫(yī)藥、保健、食品添加劑、試劑等方面的應用前景越來越廣泛.

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