邵小琳

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東臨沂 276000)

雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床治療冠狀動(dòng)脈狹窄應(yīng)用最為廣泛的支架之一，緩慢洗脫的藥物可以抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，降低支架植入術(shù)后的再狹窄率。內(nèi)皮生長暈細(xì)胞(EOCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有高度增殖潛能及強(qiáng)大的成血管能力，對預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄具有重要意義［1］。研究表明，雷帕霉素在抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也降低了EOCs的活性［2］，從而抑制了支架術(shù)后損傷內(nèi)皮的修復(fù)，導(dǎo)致術(shù)后血栓形成和內(nèi)膜增生，成為雷帕霉素藥物洗脫支架的弊端之一。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化產(chǎn)生的NO能夠促進(jìn)EOCs發(fā)揮功能［3，4］，而蛋白激酶 C(PKC)與 eNOS 及 NO 均有密切關(guān)系［5，6］。2011 年10月 ～2012年6月，我們應(yīng)用PKC抑制劑Go6976抑制PKC的活性，觀察PKC對雷帕霉素干預(yù)后的EOCs的作用，以進(jìn)一步明確雷帕霉素抑制EOCs的機(jī)制，為改善雷帕霉素藥物洗脫支架植入術(shù)后的效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza公司，胎牛血清購自Gibco公司，人纖維連接蛋白購自Chemicon公司，異硫氰基熒光素標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITCUEA-Ⅰ)購自 Sigma公司，Dil標(biāo)記的乙?；?LDL(DiI-ac-LDL)購自 Invitrogen公司，Ⅷ因子抗體、CD34抗體、Flk-1抗體購自Boster公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所中國(上海)代表處，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照Ingram等［7］報(bào)道的方法進(jìn)行。收集2011年10月～2012年5月棄用的健康產(chǎn)婦的新鮮胎盤臍帶血30例，每次采血量約30 mL。采用密度梯度離心法收集臍血中的單個(gè)核細(xì)胞，重懸于2 mL含10%胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，接種于在人纖維連接蛋白預(yù)包被的六孔板的一個(gè)孔內(nèi)。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗去未貼壁細(xì)胞并更換新鮮培養(yǎng)液。此后7 d內(nèi)每天更換一半培養(yǎng)液，7 d后每3 d更換全部培養(yǎng)液。待原代細(xì)胞生長匯合約80%后傳代，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 ①免疫細(xì)胞染色法:取第2代細(xì)胞接種至24孔板中，培養(yǎng)至貼壁。采用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.3%H2O2-甲醇液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的CD34、Flk-1、Ⅷ因子一抗，4℃孵育過夜。二抗結(jié)合參照ABC免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復(fù)染，于倒置相差顯微鏡下(×200)觀察染色結(jié)果。以CD34、Flk-1、Ⅷ因子染色均為陽性為正在分化的EOCs細(xì)胞。②熒光染色法:在上述細(xì)胞中加入DiI-ac-LDL(10 mg/L)37℃孵育4 h，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗后將FITC-UEA-Ⅰ(10 mg/L)加于上述標(biāo)本中，37℃孵育1 h。采用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EOCs細(xì)胞。采用密度梯度離心法分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)第4～6 d開始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，第7～9 d形成若干個(gè)細(xì)胞集落，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞呈橢圓形鋪路石樣排列，見圖1。免疫細(xì)胞染色顯示:培養(yǎng)16～21 d的 EOCs表面 CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)均為陽性，見圖2。DiI-ac-LDL和 FITCUEA-Ⅰ熒光染色后，熒光顯微鏡觀察到雙染色陽性細(xì)胞，見封三彩圖3。

圖1 分離培養(yǎng)的EOCs(×100)

圖2 EOCs免疫細(xì)胞染色(×200)

1.2.3 細(xì)胞干預(yù) 取第2代細(xì)胞分成4組:①對照組:僅加入配制雷帕霉素的0.3%DMSO溶劑;②Go6976 組:加入 1 μmol/L Go6976;③Go6976+雷帕霉素組:加入 1 μmol/L Go6976，30 min后再加入10 μmol/L雷帕霉素;④雷帕霉素組:加入10 μmol/L雷帕霉素。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測 第2代細(xì)胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板，24 h后更換無血清的培養(yǎng)基同步24 h，然后隨機(jī)分組處理，每組3個(gè)復(fù)孔，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10 mL CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑，于37℃孵育2.5 h，酶標(biāo)儀450 nm下讀取吸光度OD值。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測 第2代細(xì)胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)。以相同細(xì)胞數(shù)接種到24孔培養(yǎng)板，24 h后更換無血清的培養(yǎng)基同步24 h，然后隨機(jī)分組處理，每組3個(gè)復(fù)孔，24 h后消化收集各組貼壁細(xì)胞，加入含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，于24孔板中放入Transwell小室(孔徑8 μm)。下室加入600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.25%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野(×400)內(nèi)的 EOCs數(shù)，評價(jià)EPCs的遷移能力。

1.2.6 黏附能力檢測 第2代細(xì)胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)，以相同細(xì)胞數(shù)接種到24孔培養(yǎng)板，24 h后更換無血清的培養(yǎng)基同步24 h，然后隨機(jī)分組處理，每組3個(gè)復(fù)孔，24 h后收集各組貼壁細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將相同細(xì)胞數(shù)的EOCs接種到96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，用Hanks液輕柔洗去各孔未貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野(×400)計(jì)數(shù)貼壁EOCs數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件包，計(jì)量資料以表示，組間資料比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力 雷帕霉素組EOCs增殖能力低于對照組(P＜0.01)。Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組高于雷帕霉素干預(yù)組(P ＜0.01)。見表1。

2.2 細(xì)胞遷移能力 雷帕霉素組EOCs遷移能力低于對照組(P＜0.01)。Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組EOCs高于雷帕霉素組(P＜0.01)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1、圖4。

2.3 細(xì)胞黏附能力 雷帕霉素組EOCs黏附能力低于對照組(P＜0.01);Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組高于雷帕霉素干預(yù)組(P＜0.01)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組EOCs增殖、遷移、黏附能力檢測結(jié)果()

表1 各組EOCs增殖、遷移、黏附能力檢測結(jié)果()

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與雷帕霉素組比較，△P ＜0.01

組別 增殖能力(OD值)遷移能力(個(gè)/視野)黏附能力(個(gè)/視野)Go6976 組 1.16 ±0.04△ 55.87 ±2.01△ 7.93 ±1.07△Go6976+雷帕霉素組 1.07±0.08△ 52.80±3.08△ 6.55±0.68△雷帕霉素組 0.77 ±0.09* 30.93 ±1.62* 2.42 ±0.74*對照組 1.07 ±0.03△ 54.07 ±2.76△ 7.08 ±1.13△

圖4 EOCs遷移能力(×400)

3 討論

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是骨髓干細(xì)胞的亞群，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅在血管新生中作用顯著，而且具有強(qiáng)烈的內(nèi)皮保護(hù)作用。EPCs主要分為兩種不同類型，即早期內(nèi)皮祖細(xì)胞和晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(也稱內(nèi)皮生長暈細(xì)胞，即EOCs)［8］。研究表明，EPCs參與冠心病介入治療后損傷內(nèi)皮的修復(fù)，能夠促進(jìn)再內(nèi)皮化過程［9～12］，維持血管內(nèi)皮完整性，抑制血栓形成和內(nèi)膜增生，對降低PCI術(shù)后血管再狹窄發(fā)生率具有重要作用。與早期EPCs相比，EOCs具有更高的增殖潛能和成血管能力［1］。EOCs參與損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，并可以促進(jìn)支架術(shù)后內(nèi)皮化，在損傷血管再內(nèi)皮化的過程中的地位更為重要［13］。

雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床應(yīng)用最為廣泛的藥物洗脫支架之一。緩慢洗脫的雷帕霉素可以抑制血管中膜平滑肌細(xì)胞的增生，使其細(xì)胞周期停滯在G1/S期，從而減少了內(nèi)膜的增厚。同時(shí)大量研究表明，雷帕霉素在抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也抑制了 EPCs活性［14～16］，使損傷血管的再內(nèi)皮化過程受到抑制，血管完整性遭到破壞，局部的炎癥反應(yīng)使得血栓形成增加，并且促進(jìn)血管中層平滑肌細(xì)胞的反應(yīng)性增生，使得內(nèi)膜增厚，血管再狹窄率增加［13］。由此可見，雷帕霉素藥物洗脫支架在冠心病介入治療中的作用是一把雙刃劍。研究雷帕霉素對EPCs功能的作用機(jī)制，找出阻斷或減弱其抑制EPCs的方法或途徑，將對雷帕霉素藥物洗脫支架的應(yīng)用帶來更廣闊的前景。

PKC是由一系列絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成的家族，PKC的活化可以抑制eNOS活性從而降低NO 的產(chǎn)生［3，4］，而 eNOS、NO 在 EPCs的動(dòng)員、歸巢、分化、增殖、遷移、黏附等方面發(fā)揮著重要作用［5，6］，是EPCs重要的生物活性分子。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PKC抑制劑Go6976干預(yù)EOCs后，可顯著改善雷帕霉素對EOCs功能的抑制，EOCs功能基本恢復(fù)到與對照組同一水平，考慮PKC可能被激活參與了雷帕霉素對EOCs功能的抑制過程，提示抑制PKC活性可改善雷帕霉素對EOCs功能的抑制作用。

本研究結(jié)果為雷帕霉素抑制EPCs的機(jī)制提出了新的認(rèn)識，為如何提高雷帕霉素支架術(shù)后EOCs的活性提供了新的方法和思路。關(guān)于PKC參與雷帕霉素導(dǎo)致EOCs功能抑制的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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