宋 葉 涵，劉 富 俊，李 冬 梅，楊 靜 峰，朱 蓓 薇

(1.大連工業(yè)大學(xué) 國家貝類加工技術(shù)研究分中心

(大連)，遼寧 大連 116034；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧 大連 116113)

0 引 言

硫酸基與多糖生物學(xué)活性有著密切關(guān)系，是否有硫酸取代、取代度及取代位置往往影響到多糖的生物活性有無和活性大小[1]。因此，確定硫酸多糖中硫酸基的取代位置是研究硫酸多糖構(gòu)效關(guān)系的重要課題。

鮑魚生殖腺多糖作為一種動(dòng)物多糖，與植物多糖相比，與人體細(xì)胞有良好的生物兼容性，無細(xì)胞毒性且可被生物體分解，并且具有一定的抗氧化活性[2]、抗血栓及抗疲勞活性[3]、免疫活性增強(qiáng)和抗凝血[4]等生物學(xué)活性。但研究主要集中在對(duì)其生物活性的探討，更深層次的研究如多糖結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)理還有待進(jìn)行。

為達(dá)到脫除硫酸基以進(jìn)行鮑魚生殖腺多糖深層次研究的目的，作者考察了稀酸水解法[5]、一步脫硫法[6]和二步脫硫法[7]在鮑魚生殖腺多糖脫除硫酸基作用中的應(yīng)用效果，以期對(duì)今后海洋動(dòng)物多糖脫硫酸化方法選擇時(shí)有所借鑒。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

皺紋盤鮑生殖腺，由大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，樣品經(jīng)冷凍干燥后粉碎待用。

二甲基亞砜、吡啶、草酸、三氧化銻、吡啶鹽酸鹽、甲醇、明膠、氯化鋇等，均為分析純。

LG－1.0型真空冷凍干燥機(jī)，沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；8050超濾攪拌器，Millipore France；T6系列紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 鮑魚生殖腺粗多糖AGP的提取

依據(jù)本課題組前期建立的蛋白酶水解提取法提取鮑魚生殖腺粗多糖(AGP)[8]。

1.3 硫酸根含量測定

采用氯化鋇－明膠法進(jìn)行檢測[9]。

1.4 脫硫酸基方法

1.4.1 稀酸水解法

稱取AGP 300mg放入具塞瓶中，加入0.1mol／L HCl 15mL，100℃加熱分別水解1.5和2.5h，取出，冷卻，立即用1mol／L NaOH 溶液進(jìn)行中和至pH為7。中和液超濾除鹽，冷凍干燥獲得脫硫酸多糖DS－AGP1和DS－AGP2。

1.4.2 一步脫硫法

稱取AGP 100mg放入具塞瓶中，加入二甲基亞砜9mL，120℃加熱15min，使多糖全部溶解，冷卻，加入吡啶500μL，草酸150mg，三氧化銻200mg，最后補(bǔ)充吡啶1mL，120℃反應(yīng)3h，待反應(yīng)液冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的碳酸氫鈉溶液5mL，搖勻后透析72h以上，冷凍干燥獲得脫硫酸多糖DS－AGP3。

1.4.3 二步脫硫法

首先將鮑魚生殖腺多糖由鈉鹽型轉(zhuǎn)變?yōu)檫拎}型：稱取AGP 90mg溶解于6mL蒸餾水中，用0.1mol／L吡啶鹽酸鹽溶液透析24h，冷凍干燥即為鮑魚生殖腺多糖吡啶鹽。第二步溶劑離解脫硫酸基。延長加熱時(shí)間可以提高硫酸基的解離程度，因此采用兩種不同的處理，比較加熱強(qiáng)度對(duì)鮑魚生殖腺多糖硫酸基脫除的影響。處理一：將鮑魚生殖腺多糖吡啶鹽酸鹽溶于10mL體積比V(二甲基亞砜)∶V(甲醇)∶V(吡啶)＝87∶10∶3的溶液中，80℃加熱4h，冷卻后，蒸餾水透析72h以上，冷凍干燥獲得脫硫酸多糖DS－AGP4。處理二：同處理一，不同之處在于100℃加熱6h，冷凍干燥獲得脫硫酸多糖DS－AGP5。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀酸水解法脫除硫酸基

稀酸水解法脫硫衍生物DS－AGP1和DSAGP2紅外光譜見圖1，其中1 253cm－1左右的吸收表明為S═ O伸縮振動(dòng)，830cm－1左右的吸收為C—O—S的拉伸振動(dòng)，證明DS－AGP1和DSAGP2均有SO2－4特征吸收峰，其余各峰的峰形和位置，仍與AGP類似，說明多糖分子的母體結(jié)構(gòu)并未被破壞。將樣品AGP、DS－AGP1和DSAGP2的紅外吸收峰相比較可以看出，DS－AGP2的2個(gè)SO2－4的特征吸收峰強(qiáng)度較AGP明顯減弱，但尚未達(dá)到良好的硫酸基脫除效果，推測可能是由于反應(yīng)時(shí)間短，脫硫效果不明顯。

圖1 稀酸水解法脫硫樣品的FTIR圖譜Fig.1 The FTIR spectra of the desulfated sample of the hydrolysis by diluted acid method

2.2 一步脫硫法

在多糖AGP的紅外光譜中，3 433和1 053cm－1附近有強(qiáng)吸收，示有—OH的O—H鍵伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)；2 937和1 412cm－1附近有吸收，分別示有C—H鍵的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，均表現(xiàn)為多糖的特征吸收峰。多糖在1 253cm－1的強(qiáng)吸收峰，證明有—OSO3—基團(tuán)的S ═O伸縮振動(dòng)，836cm－1處為—OSO3—基團(tuán)的C—O—S伸縮振動(dòng)。通過AGP與一步脫硫法脫硫衍生物DS－AGP3相比較，從紅外光譜圖2可以看出，第一，多糖的各特征吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)(以3 398、2 929和1 242cm－1處的特征吸收峰最明顯)，可能是由于多糖羥基受到一步脫硫法反應(yīng)條件或反應(yīng)試劑的影響，使多糖的羥基形成氫鍵，引起羥基振動(dòng)頻率及S ═O鍵振動(dòng)頻率降低，從而波數(shù)變小。第二，脫硫后多糖在727cm－1出現(xiàn)了強(qiáng)吸收峰，表明產(chǎn)物中有(CH2)n基團(tuán)。通過IR圖譜分析可知，由于一步脫硫法采用120℃超高溫處理?xiàng)l件，可能導(dǎo)致多糖分子的骨架結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。

2.3 二步脫硫法

圖2 一步脫硫法脫硫樣品的FTIR圖譜Fig.2 The FTIR spectra of the desulfated sample of the one－step desulfurization method

圖3 二步脫硫法脫硫樣品的FTIR圖譜Fig.3 The FTIR spectra of the desulfated sample of the two－step desulfurization method

從紅外光譜圖3中可以看出，第一，AGP經(jīng)過Chizhov A.O.法[7]處理后得到的脫硫衍生物DS－AGP5在1 253cm－1處S ═O鍵特征吸收峰消失，結(jié)合明膠比濁法[9]對(duì)其進(jìn)行硫酸基含量測定，得到硫酸基脫除率為87.64%，說明脫硫比較徹底。但脫硫衍生物DS－AGP5在3 400、1 400～1 200和1 200～1 000cm－1附近的多糖類化合物的特征性吸收峰未發(fā)生改變，證明二步脫硫法未對(duì)多糖分子的母體結(jié)構(gòu)造成破壞。第二，對(duì)比DS－AGP4和DS－AGP5的紅外光譜圖，可發(fā)現(xiàn)當(dāng)提高加熱溫度并延長加熱時(shí)間時(shí)，可顯著提高其脫硫效果。因此，加熱強(qiáng)度可能是影響脫硫度的另一個(gè)重要因素。

3 討 論

稀酸水解法脫除硫酸基同一步脫硫法和二步脫硫法相比，脫硫效果不理想，并且反應(yīng)是在高溫下進(jìn)行，能起到顯著的降解作用，副反應(yīng)明顯，影響所得樣品的性質(zhì)。

一步脫硫法同其他方法相比，最突出的特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作簡單，只需要一次反應(yīng)即可，理論上可以最大限度地減少多糖樣品在實(shí)驗(yàn)過程中的損失。但紅外光譜圖顯示，曲線形狀(吸收峰)與原樣品相比發(fā)生較大變化，可能是由于該法采用超高溫(120℃)處理?xiàng)l件，在脫除硫酸基的同時(shí)使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，所以一步脫硫法并不是理想的鮑魚生殖腺多糖的脫硫方法。

二步脫硫法因需要反復(fù)透析、凍干，所以需要的實(shí)驗(yàn)操作條件相對(duì)較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期延長，并且多步驟操作可能會(huì)增加多糖樣品損失，回收率較低。但是該法與其他方法相比，脫硫后的SO2－4吸收峰(1 253cm－1)強(qiáng)度顯著降低，硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降到2.23%，硫酸根脫除率為87.64%，說明脫硫比較徹底，并且該法未對(duì)多糖分子的母體結(jié)構(gòu)造成破壞，所以二步脫硫法是一種較為理想的鮑魚生殖腺多糖的脫硫方法。

這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究鮑魚生殖腺多糖的構(gòu)效關(guān)系提供了良好的研究基礎(chǔ)。

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