劉志洋，王會芳，何海斌，劉 娜，王金萍，彭 雪，王子真，高俊濤 (吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林 132013)

有關(guān)腦片膜片鉗技術(shù)最早可追溯至1985年，美國的Gray和Johnston采用酶解撕裂法對豚鼠海馬腦片GABA受體通道進行了研究。而將膜片鉗技術(shù)成熟地應(yīng)用于離體腦片神經(jīng)元則是1989年，德國馬普研究所Edwards、Sakmann和日本京都大學(xué)Takahashi首次將微分干涉相差技術(shù)應(yīng)用到膜片鉗技術(shù)領(lǐng)域，并對大鼠(海馬，視皮層，嗅球，小腦，額葉皮層和脊髓等)、小鼠(海馬)、貓(視皮層)神經(jīng)元離子通道特點進行了廣泛研究。近年來隨著膜片鉗技術(shù)的日益成熟，利用腦片研究神經(jīng)細(xì)胞的電生理活動具有其獨特的優(yōu)勢。其可以保留較完整的纖維聯(lián)系與空間結(jié)構(gòu)，同時又能排除在體內(nèi)復(fù)雜的因素對其影響，使得研究變得簡單化［1-2］。因此腦片在研究神經(jīng)病、癲癇、電生理反應(yīng)、微管相關(guān)蛋白tau表達及在各種條件下?lián)p傷程度等實驗中有重要的應(yīng)用，腦片培養(yǎng)技術(shù)十分重要，腦片的制取和培養(yǎng)也越來越突出了它的重要性［3］。目前，國內(nèi)已經(jīng)開始發(fā)展幼鼠海馬腦片的技術(shù)，但可能因為各種不適條件或方法的不同［4］而產(chǎn)生誤差甚至是失敗，本文詳細(xì)介紹一種幼鼠腦片的制備步驟及制備的過程以及可能遇到并需要注意的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生1～2 d的Wistar乳大鼠由吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑

人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126，KCl 3.0，KH2PO41.2，NaHCO326，CaCl22.5，MgCl23.3。(每 250 mL ACSF用量:10×Stock 25 mL;ddWater 225 mL;CaCl2600 μL;MgCl2325 μL);葡萄糖 0.45 g(pH 7.4)。

Cutting solution pH 7.4成分(g/L):Choline chlofide 167.5;KCl 1.94;CaCl275μL;MgCl21 050 μL;NaHCO321.8;NaH2PO41.5;Glucose 27;A-scorbate acid 25.7(每150 mL Cutting solution用量:10 × Stock 15 mL;ddwater 135 mL;CaCl275 μL;MgCl21 050 μL;Glucose 0.405 g;Ascorbate acid 0.039 g)。瞬間粘合劑(Loctite 404TM膠);振動切片機(MA752 Motorised Advance Viborslice UK);腦片孵育槽;恒溫水浴鍋。

1.3 切片方法

將5%的瓊脂塊，裁成適當(dāng)大小，在振動切片機(MA752型，Campden Ins，UK)標(biāo)本托上涂上少許瞬間粘合劑(404TM膠)，將修整好的瓊脂粘貼在標(biāo)本托上;制備250 mL ACSF，放在冰箱中，控溫于2～4℃，然后取100 mL燒杯，加入80 mL ACSF，通入混合氣體(95%O2+5%CO2)飽和，置于36℃的恒溫水浴鍋中;制備150 mL Cutting soluion，置于冰箱中控溫0～2℃，然后在切片槽中，加滿Cutting soluion，并通入混合氣體(95%O2+5%CO2)，待各溶液達到指定溫度后，使用乙醚麻醉動物。

選用出生1～2 d的Wistar乳大鼠，乙醚麻醉下迅速斷頭取腦(留少許小腦，便于將大腦固定在瓊脂上)，將剝離好的大腦切平，置于混合氣(95%O2+5%CO2)飽和的4℃ Cutting Solution中，然后取出大腦，平齊放在刀片上，用濾紙吸干Cutting Solution，在標(biāo)本托涂上少許瞬間粘合劑(404TM膠)，然后垂直粘貼于在振動切片機標(biāo)本托上。在4℃和供氧混合氣條件下，用振動切片機將海馬沿長軸順橫向的纖維走向切成厚為300 μm的薄片6～10片。切片時，振動切片機切割速度調(diào)在3～4(約0.14 mm/s)，振動頻率選9(約3 500 r/min)。然后將切好的腦片置于混合氣飽和的ACSF中，室溫下孵育0.5 h待用。

2 結(jié)果

腦片顏色觀察可見，健康腦片呈淡黃色，如果腦片變白則表明活性喪失。將制得的腦片放在紅外顯微鏡下觀察其形態(tài)，可以看出圖1細(xì)胞的外形輪廓清晰，軸突較為明顯，活性較高，而圖2由其他方法制備的細(xì)胞胞體較大，空泡、軸突消失，活性較差。因此比較得出由此方法制備的腦片活性較高。

圖1 細(xì)胞活性較好(40×)

圖2 細(xì)胞活性喪失(40×)

3 討論

腦片的完好制備，尤其是腦片的細(xì)胞活性狀態(tài)是膜片鉗實驗成功的重要前提基礎(chǔ)。本實驗通過對大量腦片制備過程的觀察，在動物的選擇和腦片的制備細(xì)節(jié)上總結(jié)以下需要注意的問題。

動物:一般選擇出生1～2 d的乳鼠。原因有三:一是幼年動物顱骨軟，取腦快，冷卻也快;二是幼年動物抗缺氧能力比較強;三是幼年動物腦細(xì)胞膜韌性好，易于形成高阻封接，而成年或老年動物細(xì)胞脆性較大，顱骨較硬，不易封接和剝離。

麻醉:麻醉劑常用乙醚，其作用短暫，對動物影響較小。采用不使用麻醉劑而直接斷頭的方法會引起動物的應(yīng)急損傷，同時不符合動物保護的要求。在本實驗中，由于新生動物非常小，也可使用冰凍昏迷法而無需使用麻醉劑。

取腦:取腦時間(從斷頭到將腦浸入Cutting Solution中的時間)對腦片制備影響較大，一般以1～3 min較好。為保證腦片的存活，必須自始至終堅持無菌原則;分離大腦動作要輕柔、迅速，整個分離、切片時間最好應(yīng)控制在5 min之內(nèi);在本實驗中，由于采用全腦切片，冷卻時間應(yīng)控制在30～50 s內(nèi)。

切片(以NVSLM1型振動切片機為例)相關(guān)注意事項為:(1)整個切片過程要求無菌操作，所有動物、解剖器具、切片機、浴槽及其他溶液均需消毒處理;(2)振動切片機在切割時刀片的振動頻率要盡可能高，但應(yīng)以刀片不產(chǎn)生垂直振動為準(zhǔn)，一般選擇振動頻率為9(約3 500 r/min);(3)設(shè)定好所要切片的厚度后，務(wù)必將刻度盤鎖住;(4)對一般腦組織來說，切片厚度在300 μm為宜，因為若腦片太薄(＜150 μm)不利于細(xì)胞的存活，但如果腦片太厚(＞500 μm)，細(xì)胞不易得到充足的氧氣，細(xì)胞存活率也會降低;(5)加入浴液，一般切片在液面下1 mm左右深度進行，液體溫度保持在0～4℃，并不斷通入氧氣混合氣;(6)振動切片機在切割時刀片的切割推進速度應(yīng)盡量慢些，以防止擠壓大腦;(7)不同部位的切片的頻率不一樣，需要注意;(8)刀片可采用不銹鋼刮胡刀片，裝片時要用酒精消毒，且刀片均為一次性使用，切完以后刀片抬高一點，再退刀片，這樣對腦片的活性大有幫助。

腦片孵育:(1)孵育的紗網(wǎng)選用尼龍絲襪面料制作，原則是透水性好、質(zhì)地光滑，腦片不易粘附;(2)采用醫(yī)用輸液器的細(xì)塑料管(帶有針頭)給予氧混合氣，為增大氣體與ACSF的接觸面積，要將針孔用鉗子夾扁，使氣體在ACSF中形成非常小的氣泡，同時還可以節(jié)省氧混合氣(95%O2+5%CO2);(3)處于孵育中的腦組織，需要在一個穩(wěn)定的環(huán)境下恢復(fù)，通入混合氣體時，氣流不應(yīng)過大，否則會很容易吹動腦片組織，引起死亡。

［1］劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2006:168-175.

［2］康華光.膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用［M］.武漢:科學(xué)出版社，2003:100-103.

［3］劉振偉，李立君，劉傳繢.海馬腦片盲法膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)［J］.生理學(xué)報，2001，53(5):405-408.

［4］王 勇，朱小南，陳汝筑，等.新生大鼠海馬腦片培養(yǎng)方法［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2005，19(1):70-74.