劉振林，潘玉霞，楊盼盼，楊俊明

(1河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北秦皇島，066600;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院)

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長物質(zhì)對培養(yǎng)材料的形態(tài)發(fā)生起到明顯的調(diào)節(jié)作用。在過去的幾十年中，人們合成了許多能影響植物生長和形態(tài)發(fā)生的化合物，其中包括氯化苯氧乙酸類除草劑2，4-D(2，4-Dicholrophenoxyacetic acid)。近年來，它作為一種高效的植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)快速繁殖體系中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 2，4-D的物理性質(zhì)與化學(xué)結(jié)構(gòu)

2，4-D是一種幾乎不溶于水，易溶于酒精的白色晶體，可以用少許1 mol/L NaOH溶液助溶，能不同程度地溶于醇、苯、醚、酮等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在其分子結(jié)構(gòu)中具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有帶羧基的側(cè)鏈，在環(huán)與羧基之間有一定的立體結(jié)構(gòu)(圖1)［1］。

圖1 人工合成除草劑2，4-D的結(jié)構(gòu)簡式

2 2，4-D在植物細(xì)胞離體培養(yǎng)中的應(yīng)用

根據(jù)細(xì)胞全能性學(xué)說，植物體內(nèi)所有活的植物細(xì)胞都具有全能性，能通過胚胎發(fā)生或器官發(fā)生途徑發(fā)育成完整植株。其脫分化和再分化的過程主要通過培養(yǎng)基中添加的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)，其中以生長素和細(xì)胞分裂素的應(yīng)用最為廣泛。2，4-D在植物組織培養(yǎng)中通過獨立或與其他生長調(diào)節(jié)物質(zhì)共同對植物細(xì)胞起到誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。

2．1 2，4-D與植物愈傷組織誘導(dǎo)

在形態(tài)發(fā)生的早期階段，稱為愈傷組織的未分化細(xì)胞團(tuán)開始發(fā)育。在植物愈傷組織誘導(dǎo)過程中，人們通常在培養(yǎng)基中添加生長素類物質(zhì)以誘導(dǎo)植物愈傷組織的發(fā)生和細(xì)胞增殖，如NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，2，4-D。其中2，4-D對植物愈傷組織增殖最有效。在大多數(shù)植物組織培養(yǎng)研究中，通常使用2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織的濃度為10－5～10－7mol/L［2］，其形成愈傷組織的速度和數(shù)量都比其它生長素類物質(zhì)明顯快和多。

在一些試驗中，2，4-D對植物愈傷組織的誘導(dǎo)是必不可少的。在大多數(shù)禾本科植物如小麥、大麥、水稻和黑麥的花藥培養(yǎng)中，外源生長素，特別是2，4-D(1～3 mg/L)，是啟動小孢子細(xì)胞分裂形成愈傷組織的必要條件。只有在添加一定濃度2，4-D的培養(yǎng)基上，大麥胚乳才能產(chǎn)生愈傷組織，而在添加其他種類生長素的培養(yǎng)基則不能［3］。小麥成熟胚再生體系的研究多采用2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織［4～7］。桑樹只有在添加2，4-D的培養(yǎng)基上才能誘導(dǎo)出愈傷組織［8］。

2，4-D可單獨使用誘導(dǎo)愈傷組織，但與其他一些植物激素如KT，NAA，6-BA等結(jié)合使用更能有效地誘導(dǎo)愈傷組織［9～11］。一些秈稻品種在成熟胚上誘導(dǎo)愈傷組織時，激素只用2，4-D 誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量很差或不能有效誘導(dǎo)出愈傷組織［12，13］。丁路明等［14］在誘導(dǎo)早熟禾愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，在2，4-D和6-BA配合使用時，愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率要優(yōu)于單獨使用2，4-D的情況。2，4-D通過與其他激素結(jié)合，誘導(dǎo)花椒嫩葉(MS+2，4-D 0．5 mg/L+BA 0．5 mg/L)［15］、駿棗葉片(MS+6-BA 0．5 mg/L+2，4-D 1．5 mg/L)［16］、天師栗葉片(MS+2，4-D 0．5 ～1．5 mg/L+TDZ 0．05 ～1．0 mg/L)［17］、花燭莖尖(MS+6-BA 1．0 mg/L+2，4-D 0．1 mg/L)［18］、花葉木槿葉片(MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0．2 mg/L+2，4-D 0．2 mg/L)［19］、微甘菊芽尖和嫩莖(MS+2，4-D 2．0 mg/L+KT 1．0 mg/L)［20］、水稻(NB+2，4-D 2．0 mg/L+6-BA 0．5 mg/L)［21］、草莓“嫜姬”葉片(MS+6-BA 3．0 mg/L+2，4-D 0．2 mg/L)［22］、非洲山毛豆嫩莖(MS+2，4-D 1．00 mg/L+6-BA 0．70 mg/L)［23］形成愈傷組織，均取得了比較好的結(jié)果。

由于2，4-D很容易引起愈傷組織的形成，因此當(dāng)要通過腋芽生枝或不定芽發(fā)育進(jìn)行莖芽繁殖時，應(yīng)當(dāng)避免使用。

2．2 2，4-D 與芽的形成

一般在培養(yǎng)基中添加較高濃度的細(xì)胞分裂素和較低濃度的生長素類物質(zhì)能促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和不定芽的產(chǎn)生。2，4-D雖是一種高效促進(jìn)愈傷組織增殖的生長素，但同時也是一種器官抑制劑，它有抑制芽形成的副作用。為了利于芽的分化，在分化培養(yǎng)基上，一般應(yīng)去掉2，4-D，添加細(xì)胞分裂素［24］。

但也有例外。2，4-D是影響馬尾松未成熟合子胚不定芽誘導(dǎo)的最顯著因素［25］。2，4-D在與其它生長調(diào)節(jié)物質(zhì)結(jié)合時，若配比得當(dāng)，也可產(chǎn)生芽。樂東擬單性木蘭莖段在WPM+BA 1．5 mg/L+KT 0．5 mg/L+NAA 0．2 mg/L+2，4-D 0．2 mg/L 的培養(yǎng)基上，能產(chǎn)生較多的不定芽［26］。MS+6-BA 0．5 mg/L+2，4-D 4 mg/L對促進(jìn)大葉種茶樹腋芽分化效果明顯，培養(yǎng)20 d后，芽分化率達(dá)81%，單生芽長約1 cm，葉片展開［27］。

在唐菖蒲組織培養(yǎng)快繁的研究中，MS+1 mg/L 2，4-D+0．5 mg/L KT+0．5 mg/L BA可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，縮短培養(yǎng)周期［28］。

2．3 2，4-D與體細(xì)胞胚胎發(fā)生

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是離體培養(yǎng)材料形態(tài)發(fā)生和植株再生的一條有效途徑。一般認(rèn)為2，4-D是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最重要的激素，多數(shù)植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)都需要2，4-D。誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生時使用 2，4-D 的常用濃度為 100 ～2 000 μmol/L［29］。

地被菊葉片外植體在添加0．75 mg/L 2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)15 d，再進(jìn)行分生培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生［30］?；ㄉ咻S誘導(dǎo)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至2，4-D 20 mg/L的MS培養(yǎng)基上形成體細(xì)胞胚［31］。

通過改變生長素和細(xì)胞分裂素的比例，能刺激體細(xì)胞形成胚組織。甜瓜在MS+BA 0．5 mg/L+2，4-D 1 mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的效率最高［32］。以仙客來的葉片為外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，在MS+BA 2 mg/L+KT 0．2 mg/L+2，4-D 0．5 mg/L 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚狀體，其誘導(dǎo)率為100%［33］。毛葉海棠胚狀體的誘導(dǎo)需生長素和細(xì)胞分裂素配合，對比細(xì)胞分裂素與2，4-D配合的培養(yǎng)結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)毛葉海棠胚狀體的誘導(dǎo)，細(xì)胞分裂素是必需，同時也依賴于生長素的作用，而且生長素的濃度較高［34］。

2，4-D的作用具有階段性，在誘導(dǎo)體胚階段通常起促進(jìn)作用，而在胚狀體分化發(fā)育階段一般起抑制作用［35］。0．5 mg/L 2，4-D 是誘導(dǎo)胚性愈傷組織最適宜的生長素濃度［36］，降低或去掉2，4-D，胚性細(xì)胞才能按照體胚的發(fā)育途徑正常發(fā)育。枸杞胚性愈傷組織形成后，如不及時降低或去掉2，4-D，則胚性細(xì)胞不能正常發(fā)育［37］。Saunders等［38］的研究表明，紫花苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)需要高濃度的2，4-D，而體細(xì)胞胚的形成則必須要降低2，4-D濃度或?qū)⑵淙コ?，否則胚性愈傷組織會在生長素的持續(xù)刺激下不斷產(chǎn)生愈傷組織，始終不能形成成熟的體細(xì)胞胚或再生植株。在三葉草、芹菜的組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，如不及時降低2，4-D的濃度，那么球形胚就產(chǎn)生次生胚［39，40］。朱長甫等［41］的研究表明，在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，以2，4-D誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成過程中能釋放糖蛋白，且及時去除2，4-D是使胚性細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育的前提。

2，4-D對百合體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)具有雙重作用，它能啟動胚狀體發(fā)生中胚胎蛋白合成的早期反應(yīng)，又能阻止胚狀體發(fā)育成熟過程中必需蛋白質(zhì)的進(jìn)一步合成。因此，百合鱗片外植體在含2，4-D的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)約5 d后，轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基培養(yǎng)，即可直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚［42］。

在地被菊誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的研究中，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+KT 2．0 mg/L+2，4-D 2．0 mg/L+NAA 0．5 mg/L，誘導(dǎo)10 d 后，轉(zhuǎn)入去除2，4-D 的體胚發(fā)育培養(yǎng)基MS+KT 2．0 mg/L+NAA 0．5 mg/L 中培養(yǎng)30 d，體胚發(fā)生率最高為93．0%，平均每外植體分化的體胚數(shù)為13．6個［43］。

龍牙百合試驗結(jié)果表明:影響龍牙百合體細(xì)胞胚發(fā)生方式的因素是2，4-D。當(dāng)2，4-D的質(zhì)量濃度低于0．5 mg/L時，體細(xì)胞胚以直接方式發(fā)生。當(dāng)2，4-D濃度適中時，體細(xì)胞胚以間接方式發(fā)生，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+0．5 mg/L 6-BA+2．0 mg/L 2，4-D，在分化形成體細(xì)胞胚時，需降低或去除 2，4-D［44］。

然而，并不是所有植物體細(xì)胞胚發(fā)生都需要2，4-D。2，4-D對邊防金花茶體細(xì)胞胚的發(fā)生不是必需的，而且高濃度的2，4-D不利于胚狀體的形成［45］。

2．4 2，4-D 與根的形成

2，4-D不能啟動根的分化，一般不宜用來誘導(dǎo)生根。但也有特例，在蛇尾蘭屬植物的培養(yǎng)中，2，4-D能夠誘導(dǎo)根的形成［46］。

3 2，4-D調(diào)節(jié)植物形態(tài)發(fā)生的機(jī)理

3．1 2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織的機(jī)理

在培養(yǎng)基中，最重要的影響因素莫過于外源的植物激素組合，通常高濃度的生長素和低濃度的激動素有利于植物愈傷組織的誘導(dǎo)和增值。這其中2，4-D是誘導(dǎo)植物愈傷組織最有效的物質(zhì)。據(jù)研究，cdc2/CDC2基因被證明是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的基因，在其作用下，細(xì)胞分裂可從G1期轉(zhuǎn)入S期、G2期和M期。該基因的產(chǎn)物為一個3 kb的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶P34cdc2的磷酸化作用所調(diào)節(jié)。在分化細(xì)胞中P34cdc2水平降低，說明調(diào)節(jié)作用已經(jīng)完成，而2，4-D具有通過調(diào)節(jié)P34cdc2蛋白合成而控制脫分化和細(xì)胞分裂重新啟動的作用［47］。

3．2 2，4-D對誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的機(jī)理

2，4-D是誘導(dǎo)多種植物離體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的重要激素，其作用機(jī)制可能是:①通過激活一些基因表達(dá)特異蛋白以促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)育，也可以抑制這些基因表達(dá)以抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)育;②2，4-D濃度與核DNA甲基化有關(guān);③可能與培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)部因子有關(guān)(通過改變細(xì)胞內(nèi)源IAA而起作用)［48～50］。

4 需要進(jìn)一步研究的問題

2，4-D作為一種高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有生長素的作用。從眾多試驗可以看出，2，4-D在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用既有廣泛性，又有局限性。

廣泛性表現(xiàn)在:2，4-D較其它生長素類物質(zhì)，誘導(dǎo)愈傷組織最為有效，因而廣泛應(yīng)用。2，4-D是胚培養(yǎng)最重要的激素，多數(shù)植物的體細(xì)胞胚發(fā)生都需要2，4-D。

局限性表現(xiàn)在:一般在培養(yǎng)基中添加較高濃度的細(xì)胞分裂素和較低濃度的生長素類物質(zhì)能促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和不定芽的產(chǎn)生，而2，4-D在大多數(shù)試驗中都表現(xiàn)出對芽形成的抑制作用。同樣，2，4-D不能啟動根的分化。此外，一些研究表明，2，4-D不受吲哚乙酸的氧化酶的降解作用，能在植物體內(nèi)保留較長時間引起染色體變異，有一定的致癌作用及殘留效應(yīng)。

針對2，4-D在組織培養(yǎng)的應(yīng)用中存在的局限性，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)其在調(diào)節(jié)植物形態(tài)發(fā)生機(jī)理方面的研究，以便使其在植物的組織培養(yǎng)中發(fā)揮更大的作用。

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