李一帆，崔柳青，韓 康，薛樂(lè)勛#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001 2)河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州 450001

葉綠體基因工程是高效表達(dá)外源蛋白的有效途徑之一，與核轉(zhuǎn)化相比，其具有基因拷貝數(shù)多、表達(dá)率高、遺傳性狀穩(wěn)定、能夠避免基因沉默等明顯的特點(diǎn)[1]。翻譯效率是決定表達(dá)能力的關(guān)鍵因素，一些翻譯增強(qiáng)序列能明顯提高重組蛋白的表達(dá)[2]。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列(UUAACUUUA)已經(jīng)被證實(shí)在大腸桿菌中可以作為一種翻譯增強(qiáng)序列來(lái)提高翻譯效率，但是還未見(jiàn)在植物和藻類中的報(bào)道[3]。Lux Ct是以熒光素酶基因Lux AB為基礎(chǔ)進(jìn)行適當(dāng)改造而成，含有高效的內(nèi)源性atpA基因啟動(dòng)子及5’UTR和3’UTR[4]。Mayfield等[5]用 atpA啟動(dòng)子-atpA 5’UTR-gfp基因-rbcL3’UTR組合表達(dá)盒在萊茵衣藻葉綠體中成功表達(dá)了綠色熒光蛋白。Canstatin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成抑制因子，它通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。在該研究中，作者嘗試構(gòu)建一種含有翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin杜氏鹽藻葉綠體重組表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步研究外源蛋白在杜氏鹽藻葉綠體中的表達(dá)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、載體和主要試劑Lux Ct質(zhì)粒由SP Mayfield 饋贈(zèng)，大腸桿菌DH5α為該研究室保存，PMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司，限制性內(nèi)切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ購(gòu)自NEB公司，LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMP、IPTG和X-GAL均購(gòu)自TaKaRa公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，AMV First Strand cDNA Synthesis 試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，DNA片段膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3人canstatin基因的RT-PCR擴(kuò)增采用Trizol試劑提取法提取人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞總RNA，以獲得的RNA為模板，用AMV First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA 的第一鏈。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增不添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin。擴(kuò)增在5’UTR 下游添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin時(shí)所用引物為canstatin F1和canstatin R；擴(kuò)增在3’UTR上游添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin時(shí)所用引物為canstatin F和canstatin R1。反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取20 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。

1.4克隆載體PMD18-T/Can的構(gòu)建及鑒定分別膠回收目的片段，與PMD18-T載體按物質(zhì)的量的比15于16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。藍(lán)白斑篩選，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

1.5canstatin葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ分別對(duì)Lux Ct和PMD18-T/Can進(jìn)行雙酶切，分別回收載體片段和目的片段。利用T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

2 結(jié)果

2.1未添加及添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin基因片段的擴(kuò)增結(jié)果RT-PCR所得片段約為700 bp，與預(yù)期片段大小基本一致(圖1)。

圖1 人canstatin RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2PMD18-T/Can的酶切鑒定PMD18-T/Can經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致(圖2)。

圖2 pMD18-T/Can的酶切鑒定

2.3人canstatin葉綠體重組表達(dá)載體的酶切鑒定

Lux Ct質(zhì)粒經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到2條片段，小片段大小約為2 100 bp，大片段約為10 000 bp(圖3)。將大片段進(jìn)行回收，與PMD18-T/Can雙酶切所得的載體片段連接，得人canstatin葉綠體重組表達(dá)載體。該重組質(zhì)粒經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段大小約為700 bp，與預(yù)期的人canstatin基因大小以及在5’UTR 下游、3’UTR上游添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin基因片段基本一致，表明3個(gè)片段均成功插入(圖4)。

圖3 Lux Ct的酶切鑒定

圖4 人canstatin葉綠體重組表達(dá)載體的酶切鑒定

3 討論

在全球范圍內(nèi)人們對(duì)藥用蛋白的需求量劇增的形勢(shì)下，天然來(lái)源的藥用蛋白已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。目前，許多蛋白表達(dá)系統(tǒng)用于生物制品的生產(chǎn)時(shí)都具有一定的缺陷，例如陸生植物已被證明能生產(chǎn)各種生物制品、抗體等，但周期過(guò)長(zhǎng)[7]。近年來(lái)，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，利用植物葉綠體生產(chǎn)外源蛋白已引起關(guān)注，尤其是生產(chǎn)藥用蛋白、口服疫苗等[8]。單細(xì)胞真核生物杜氏鹽藻作為一種理想的生物反應(yīng)器，含有一個(gè)大型的杯狀葉綠體。與陸生植物相比，它培養(yǎng)簡(jiǎn)單、抗逆性佳、生長(zhǎng)快并且能夠大大減少?gòu)淖畛蹀D(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)的時(shí)間[9]。這眾多優(yōu)點(diǎn)都使杜氏鹽藻具備了成為新型生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)外源生物活性物質(zhì)的巨大潛能。

人canstatin能夠有效抑制新生血管形成和抑制腫瘤生長(zhǎng)，目前這種被稱為“休眠療法”的腫瘤治療在臨床應(yīng)用上具有廣闊前景[10]。該研究以特異高效啟動(dòng)子atpA構(gòu)建載體來(lái)表達(dá)人canstatin基因。并設(shè)計(jì)利用T7噬菌體g10-L序列在不同位置來(lái)提高其表達(dá)水平，為建立一個(gè)高效表達(dá)有活性外源蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)化體系打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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