王文兵，曹 旸，紀(jì)開(kāi)萍，劉 靜，張春霞，何明霞

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100)

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌Phlebopus portentosus(Berk＆Broome)Boedijn，又名巨型牛肝菌、黑牛肝菌等，分布在中國(guó)云南、廣西和海南等地[1－3]，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受產(chǎn)地消費(fèi)者的喜愛(ài)，實(shí)現(xiàn)其人工栽培具有重要的意義。Lumyong和Sanmee[4，5]報(bào)道，在培養(yǎng)皿中以腐生菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，可產(chǎn)生子實(shí)體和擔(dān)孢子，擔(dān)孢子能夠萌發(fā)，只是子實(shí)體的形態(tài)不好，且產(chǎn)量很低。

筆者曾設(shè)計(jì)不同覆土方法研究覆土對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體形成的影響，探討其出菇與覆土的密切相關(guān)性，并通過(guò)覆土中混入細(xì)菌、放線菌的對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)覆土中的微生物對(duì)其子實(shí)體形成有一定的促進(jìn)作用[6]。本文中，筆者通過(guò)覆土中放線菌的分離純化，回接無(wú)菌覆土進(jìn)行對(duì)比栽培試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了覆土中放線菌對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)16S rDNA序列分析對(duì)有益放線菌菌株進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株

菌株編號(hào)B－01－3－11，2003年由采自云南景洪鳳凰木 (delomix regia)樹(shù)下的野生子實(shí)體分離獲得，保存于云南省熱帶作物科學(xué)研究所，其人工培養(yǎng)的子實(shí)體憑證標(biāo)本存放于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所真菌標(biāo)本室，標(biāo)本編號(hào):HKAS49706號(hào)。

1.1.2 覆土

由果園土壤、草炭等體積混合，加水至含水量60%。

1.1.3 培養(yǎng)基質(zhì)

液體培養(yǎng)基 (每升):去皮馬鈴薯200.0 g(煮沸30 min)、葡萄糖20.0 g、酵母膏1.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g。

子實(shí)體培養(yǎng)料:干橡膠木鋸末10 kg、谷粒5 kg、MgSO415 g、KH2PO45 g，加水拌勻至含水量60%，pH在6左右。分裝入500 mL玻璃廣口瓶，每瓶鮮料400 g，121℃滅菌60 min。

1.2 方法

1.2.1 覆土中放線菌的分離

采用瓊脂平板稀釋分離法:覆土在室溫下風(fēng)干10 d后取1 g加入10 mL無(wú)菌水，制成10%的土壤懸液。然后梯度稀釋使其終濃度達(dá)到10－6。取上述土壤懸液滴于加50 mg·L－1重鉻酸鉀抑制劑的改良高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板，均勻涂布，每個(gè)濃度3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d～15 d后挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于改良高氏1號(hào)瓊脂斜面。28℃培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿斜面后移至4℃冰箱保存。

1.2.2 放線菌回接覆土栽培試驗(yàn)

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種、固體菌種及放線菌菌懸液的制備方法參照曹旸等[6]的方法。

待牛肝菌菌絲長(zhǎng)滿廣口瓶中的固體培養(yǎng)基質(zhì)后，進(jìn)行覆土出菇試驗(yàn)。覆滅菌土 (121℃，60 min)，并在無(wú)菌條件下分別添加各放線菌菌懸液，混勻，使覆土中放線菌濃度約為100 cfu·g－1，之后封口培養(yǎng)至覆土層長(zhǎng)滿菌絲，再敞口培養(yǎng)[6]，以覆滅菌土為對(duì)照，覆土厚度4.0 cm，每處理7個(gè)重復(fù)。

將上述覆土后的栽培瓶移至磚混泡沫板菇房中，保持溫度28℃～30℃、光照100 lx～300 lx、濕度90%～95%培養(yǎng)。記錄牛肝菌菌絲在覆土層的生長(zhǎng)情況、原基發(fā)生及子實(shí)體生長(zhǎng)情況，并以Duncar新復(fù)極差法 (DPS7.0)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 有益放線菌菌株16S rDNA序列分析

以SK1201－UNIQ－10柱式細(xì)菌基因組 DNA抽提試劑盒，生工生物工程 (上海)公司，提取有益放線菌基因組DNA。以PCR引物 Primer 27F(5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′)和 Primer 1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT －3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系:模板10 pmol;Primer 27F(10 μmol·L－1)1 μL;Primer 1492R(10 μmol·L－1)1 μL;dNTP mixture(10 Mm each)1 μL;10 × Taq Reaction Buffer 5 μL;Taq(5 U·μL－1)0.25 μL;加水至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性98℃、5 min;循環(huán)95℃、35 s，55℃、35 s，72℃、1 min、30 s，35個(gè)循環(huán);延伸8 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化，并進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，并調(diào)出相關(guān)的16S rDNA序列用Clustal X[7，8]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò) MEGA3.1 軟件[9，10]選用 Kimura 2－parameter距離模型計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，1 000次隨機(jī)抽樣計(jì)算Bootstrap值以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌菌株對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇情況的影響

覆土中共分離純化得到37株放線菌菌株。通過(guò)回接覆土試驗(yàn)檢測(cè)它們對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇情況的影響，見(jiàn)表1。

表1 放線菌菌株對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇情況的影響

續(xù)表

從表1中可以看出，覆土中加入放線菌菌株C20、T20、C6、36、34、T30、14的處理，牛肝菌菌絲長(zhǎng)滿覆土層的時(shí)間比對(duì)照 (CK)提前3 d以上，達(dá)極顯著水平，說(shuō)明這7個(gè)菌株能夠促進(jìn)牛肝菌菌絲生長(zhǎng)。

覆土中加入放線菌菌株T5、菌株9的處理，原基發(fā)生時(shí)間比CK提前10 d以上，達(dá)極顯著水平。在原基數(shù)目上，添加放線菌菌株9、菌株21的處理與對(duì)照相比達(dá)到極顯著差異水平。說(shuō)明這四株放線菌能促進(jìn)原基發(fā)生。

在子實(shí)體成熟數(shù)上，14個(gè)添加放線菌的處理在數(shù)值上高于CK，但所有處理與兩對(duì)照相比都沒(méi)有達(dá)到顯著差異水平。

在平均單菇重量上，添加放線菌菌株17、菌株T21的處理與對(duì)照相比達(dá)到顯著差異水平，是對(duì)照的3倍以上，說(shuō)明菌株這兩株放線菌能夠促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)。

2.2 有益放線菌菌株16S rDNA序列分析

上述試驗(yàn)中，對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇有促進(jìn)作用的共有12株放線菌菌株，它們的16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)修正后已向GeneBank提交序列 (登錄號(hào):JN248568～JN248579)。根據(jù)16S rDNA序列同源性，構(gòu)建了包括這12株放線菌在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從16S rDNA序列聚類分析結(jié)果可以看出，12株放線菌中11株屬于鏈霉菌屬，1株屬于游動(dòng)放線菌屬。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

由覆土中共分離純化得到37株放線菌菌株，通過(guò)回接覆土試驗(yàn)檢測(cè)它們對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇情況的影響。其中有12個(gè)菌株分別在牛肝菌菌絲生長(zhǎng)、原基發(fā)生及子實(shí)體生長(zhǎng)等方面表現(xiàn)出促進(jìn)作用。

16S rDNA序列分析結(jié)果顯示，12株放線菌中11株可歸為鏈霉菌屬 (Streptomyces)，1株歸為游動(dòng)放線菌屬 (Actinoplanes)，將它們鑒定到種還需要進(jìn)行進(jìn)一步的生理生化試驗(yàn)。

筆者曾報(bào)道在暗褐網(wǎng)柄牛肝菌人工栽培中，覆土及覆土中微生物的重要性[6]。本文結(jié)果表明，在覆土所包含的眾多微生物中，放線菌的幾個(gè)類群可能對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體的形成和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但它們的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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