徐健，李維林

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心，江蘇南京，210014)

甜葉菊(Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl)又名甜菊、甜草、密菊、甜茶等，為菊科多年生草本植物，原產(chǎn)美洲巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脈［1］，從1899年報(bào)道這種植物以來引起了很多學(xué)者濃厚的興趣。日本在1970年引種成功之后，對甜葉菊的栽培、安全性和化學(xué)方面的研究得到很快的發(fā)展。我國自1977年由南京中山植物園、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院等科研機(jī)構(gòu)引種甜葉菊，試種成功以后迅速發(fā)展，至今全國已有23個(gè)省市自治區(qū)種植，已經(jīng)躍居為世界上最大的甜菊糖生產(chǎn)國和出口國。

甜菊糖為甜葉菊中的甜味成分，在甜葉菊的葉子、莖、根等部位均有分布，但以葉子中含量最高［1］，且其含量隨生長進(jìn)程而變化，在現(xiàn)蕾期達(dá)到最高。甜菊糖因其無毒、安全、低熱能等特點(diǎn)而備受青睞，被譽(yù)為“世界第三糖源”，有關(guān)甜菊糖的生物活性以及產(chǎn)品開發(fā)研究引起了國內(nèi)外眾多學(xué)者的興趣。

本文結(jié)合最新國內(nèi)外文獻(xiàn)，對甜葉菊的化學(xué)成分、提取純化工藝、藥理作用和產(chǎn)品開發(fā)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 化學(xué)成分及提取工藝研究

1.1 化學(xué)成分

Wollwer-Rieck［2］在2012年對從甜葉菊中分離得到的二萜苷、黃酮、酚類等化學(xué)成分做了全面的報(bào)道。其中二萜類成分約60個(gè)，絕大部分為糖苷類，但按其骨架類型分類僅有貝殼杉烷型和勞丹烷型2種。貝殼杉烷型按苷元的不同可分為4類(如圖1所示):I是13位為羥基取代，16、17為雙鍵，19位氧化為羧基;II是13位為羥基取代，15、16為雙鍵，19位氧化為羧基;III是13、16位為2羥基取代，19位氧化為羧基;IV是16位為羰基取代，19位氧化為羧基。其中I類化合物為甜葉菊的主要化學(xué)成分和甜味成分，目前報(bào)道的此類化合物有35個(gè)，其中8個(gè)化合物具有較高的甜度，是商品甜菊糖的主要成分(如表1所示)。

圖1 甜葉菊中貝殼杉烷型二萜類化合物的4種苷元Fig.1 Four different kaurene body structures of steviol glycosides

此外，Markovic等［3］用 GC-MS法從甜葉菊葉子中鑒定出88個(gè)化合物，其中17個(gè)單萜、32個(gè)倍半萜、2個(gè)二萜，其他的主要為有機(jī)酸類化合物。

1.2 提取純化工藝

1.2.1 提取工藝

甜菊糖中的所有糖苷都易溶于水，且水為溶媒具有易得、成本低、污染小等優(yōu)點(diǎn)，為目前甜菊糖工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用的提取溶劑。

表1 甜葉菊中的主要甜味成分Table 1 The main sweet chemical constituents of Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl

水煎煮法作為一種傳統(tǒng)的、經(jīng)濟(jì)的提取方法依然是當(dāng)今甜菊糖工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用的提取方法。科研工作者也不斷對水煎煮法進(jìn)行改良優(yōu)化，Chhaya等［4］對煎煮提取法工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳提取條件為料液比1∶14，78℃下提取56 min，提取效率10.45%，從經(jīng)濟(jì)合理的角度提供了新的提取工藝條件。

隨著科技的進(jìn)步，一些新的提取技術(shù)漸漸走入科學(xué)工作者的視野。其中連續(xù)逆流提取法提取甜菊糖是一種較優(yōu)的現(xiàn)代工業(yè)化提取方法，與傳統(tǒng)工藝相比其優(yōu)勢主要表現(xiàn)為操作簡單、可連續(xù)性生產(chǎn)和生產(chǎn)時(shí)間短。郁軍等［5］運(yùn)用三級逆流連續(xù)提取、三罐串聯(lián)逆流提取及單罐提取3種方法提取甜菊苷，發(fā)現(xiàn)3種方法提取率相近，其中三級逆流連續(xù)提取提取周期最短，整個(gè)過程只需要20 min，而提取率依然可達(dá)10.1%。

此外，Munish Puri等［6］及豐雪等［7］對提取過程中加入纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶等酶輔提取法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)單種生物酶輔助提取時(shí)，以半纖維素酶在提取時(shí)間為1 h、提取溫度為60℃、酶濃度為3%時(shí)甜菊糖提取率最高(約14%);若將生物酶混合使用，在提取時(shí)間為36～45 min、提取溫度為51～60℃、3種生物酶各自濃度為2%時(shí)具有最好的提取效果，相對單種生物酶輔助提取法而言其提取率和提取效率均有一定的提高。徐仲偉等［8］也對復(fù)合酶酶輔助提取的方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，確定了提取甜菊糖的最佳工藝為:酶用量0.20%，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間30 min，料液比1∶11，pH 值為5.0，加酶方式為4次平均加酶，提取7次，最終提取率可高達(dá)13.93%。此方法較大程度上提高了提取率，但操作復(fù)雜、提取周期長。

超聲提取是一種新興的提取方法，但用于甜菊糖提取的相關(guān)報(bào)道很少。劉杰等［9］對超聲波輔助提取法系統(tǒng)優(yōu)化得出其最佳提取條件為提取溫度68℃、提取功率 60 W、提取時(shí)間 32 min，提取率可達(dá)12.2%。此方法與傳統(tǒng)提取方法相比大大縮短了提取時(shí)間，同時(shí)較為顯著地提高了提取率，在甜菊糖的提起工藝中具有極高的研究價(jià)值。

Vikas Jaitak等［10］經(jīng)研究得出微波萃取的最佳提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間1 min、提取功率80 W，其提取時(shí)間大大縮短，但在提取率與傳統(tǒng)方法相比未有顯著性提高。此外，超高壓技術(shù)［11］、超臨界流體萃?。?2］等新興的提取方法也被用于甜菊糖苷提取工藝改進(jìn)的研究。

以上新的提取方法與傳統(tǒng)提取方法相比均有較為顯著的優(yōu)勢，但或因成本問題、或因可連續(xù)操作性差等關(guān)鍵因素的制約，在工業(yè)化中有一定的障礙。鑒于此，筆者認(rèn)為可以根據(jù)各種方法的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出多種方法組合提取甜菊糖苷，如超聲波提取成本低廉、周期短、提取率高、可聯(lián)系性操作，連續(xù)逆流提取甜菊糖苷具有可以較大程度提高提取率、縮短提取周期等優(yōu)點(diǎn)，將超聲原理結(jié)合連續(xù)逆流提取發(fā)提取甜菊糖苷也許是一種可行的研究方向。

1.2.2 純化工藝

由于當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)中多采用水為溶媒，在提取液中存在大量的多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)，其含量高于甜菊糖苷3～6倍，若不去除會對下一步純化產(chǎn)生很大干擾，因此對提取料液進(jìn)行前處理尤為重要。目前工業(yè)生產(chǎn)中常用的甜菊糖苷純化方法主要有醇沉法、大孔吸附樹脂法、化學(xué)絮凝法和膜分離法。

醇沉法工藝簡單，乙醇易得，毒性小，易于回收利用，成本低，是甜菊糖苷純化中常用方法。伏軍芳等［13］針對醇沉法通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醇濃度達(dá)到80%時(shí)，除雜率為16.47%，幾乎可以除去全部的淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽類雜質(zhì)，且甜菊糖苷的損失率僅為6.13%，溶液透明澄清。

除醇沉法外，在傳統(tǒng)生產(chǎn)中，普通吸附法也常常被用來純化甜菊糖，即先采用化學(xué)絮凝劑、活性炭吸附雜質(zhì)，再用陰陽離子樹脂進(jìn)行脫鹽、脫色以達(dá)到純化目的。不過，化學(xué)絮凝劑［13］、改性凹凸棒石法［13］的選擇性較差，甜菊糖苷損失率較大，隨著除雜率的升高其損失率也顯著上升，如化學(xué)絮凝除雜中，當(dāng)除雜率為24.12%時(shí)，損失率高達(dá)12.29%;當(dāng)除雜率為31.44%時(shí)，損失率為17.98%。

大孔吸附樹脂分離技術(shù)以其穩(wěn)定的理化性質(zhì)、較好的選擇性、吸附和交換速度快、再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被越來越廣泛地應(yīng)用于甜菊糖苷的純化和分離。張強(qiáng)華等［14］從001×16陽離子交換樹脂、D941、AB-8、DM130、HPD-100、NKA-9、D392、D3520 八種大孔樹脂中篩選出了脫色效果最佳的樹脂為D941，并得出其靜態(tài)脫色的最佳條件為吸附時(shí)間90 min，溫度45℃，pH為8.5，樹脂用量60 g/L時(shí)脫色效果最佳。

近年來膜技術(shù)的研究和應(yīng)用得到迅速發(fā)展，如電滲析、微孔過濾、超過濾、反滲透等膜分離技術(shù)均對甜菊糖的純化工藝具有意義。陳紹潘等［15］先采用微孔過濾、超過濾除去大分子雜質(zhì)，再使用反滲透進(jìn)行過濾液的濃縮。他們認(rèn)為此技術(shù)具有通量大、效果好、速度快、節(jié)能等優(yōu)勢，但膜清洗過程復(fù)雜，使整個(gè)生產(chǎn)周期延長、成本增加。趙永良等［16］把甜菊葉泡液過一級膜除雜，再經(jīng)過二級膜濃縮，經(jīng)過大孔樹脂后噴霧干燥得到產(chǎn)品甜菊糖苷。此工藝采用膜分離技術(shù)取代傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中絮凝過程，由于膜分離過程無有色離子滲入，故可以簡化點(diǎn)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中個(gè)的離子交換樹脂過程，改良工藝的應(yīng)用提高了甜菊糖苷的純度以及生產(chǎn)效率、膜再生率大幅提高。姚國新等［17］先用微濾膜和超濾膜兩級膜對甜菊糖水提液進(jìn)行除雜，除掉果膠、色素、水溶性蛋白等雜質(zhì)，再用納濾膜進(jìn)行脫鹽濃縮。結(jié)果表明，經(jīng)過膜處理后的液體濃縮了15倍，純度達(dá)到87%左右。

與傳統(tǒng)的醇沉、絮凝、大孔樹脂柱層析等甜菊糖苷工業(yè)純化工藝相比，膜技術(shù)純化甜菊糖苷具有純化效果好、速度快等優(yōu)勢，隨著膜技術(shù)的發(fā)展和膜再生技術(shù)的進(jìn)步，其在甜菊糖苷的工業(yè)化生產(chǎn)中逐步取代傳統(tǒng)工藝為今后工業(yè)生產(chǎn)的趨勢。

1.2.3 精制、分離萊鮑迪苷A

經(jīng)過除雜、脫色后的甜菊糖為混合物，主要成分是甜葉菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C等，尤其是甜葉菊苷、萊鮑迪苷A所占比例比較大，而在這些成分中萊鮑迪苷A的甜度最高、甜味最好，口感也最接近葡萄糖。因此，眾多的研究者和生產(chǎn)者將提高萊鮑迪苷A的含量作為甜菊糖產(chǎn)品品質(zhì)提高的切入點(diǎn)。

李培等［18］對重結(jié)晶法分離萊鮑迪苷A的技術(shù)進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上趙昊等［19］用溶析結(jié)晶法分離萊鮑迪苷A，在甲醇中添加50%乙酸乙酯，溶液濃度20 g/L，結(jié)晶溫度18℃下的結(jié)晶率為0.34，分離系數(shù)可達(dá)3.8。劉杰等［20］采用甲醇-異丙醇(體積比99∶1)誘導(dǎo)結(jié)晶的方法分離萊鮑迪苷A，并對結(jié)晶溶劑、固液比、溫度、時(shí)間、加入晶種等影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果一次重結(jié)晶的相對純度可達(dá)92.7%，結(jié)晶率0.61，二次重結(jié)晶純度可達(dá)95.8%，結(jié)晶率0.35。此類方法具有操作簡單、成本低的顯著優(yōu)勢，但結(jié)晶過程中晶格易將結(jié)晶所用有機(jī)溶劑(如甲醇、乙酸乙酯等)包裹，而被晶格包裹的有機(jī)溶劑是很難通過加熱干燥等普通的手段去除而易造成有害有機(jī)溶劑殘留。

大孔樹脂吸附法是精制分離甜菊糖苷的最常用的一種方法。胡靜等［21］對幾種大孔樹脂進(jìn)行優(yōu)選，發(fā)現(xiàn)D107和D108型大孔樹脂對甜菊糖中的萊鮑迪苷A和甜葉菊苷有較強(qiáng)的分離能力，D107的吸附容量大，能使甜菊糖中的萊鮑迪苷A含量達(dá)到80%以上，而D108的吸附量小于D107，但能使甜菊糖中的萊鮑迪苷A含量達(dá)到90%。Li等［22］使用混合床離子交換樹脂對甜菊糖中的萊鮑迪苷A進(jìn)行分離純化，可使其純度提高到97%。

此外，還有關(guān)于高速逆流色譜法［23］、高效液相色譜法［24］、毛細(xì)管電泳法［24］等先進(jìn)的分離方法用于分離富集萊鮑迪苷A的報(bào)道，但這些方法通量小，一般僅用于實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定。

2 藥理活性及安全性

作為新糖源，甜葉菊的藥理活性和安全性研究一直以來是眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，目前報(bào)道的甜菊糖生物活性非常廣泛，其中研究較為深入的主要為抗糖尿病、降血壓、抗菌抗病毒、抗炎等活性。

2.1 藥理活性

2.1.1 抗糖尿病活性

在多年前美洲就已經(jīng)把甜葉菊的葉子作為抗糖尿病藥物使用，而現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證明甜葉菊葉子［25］具有較好的抗糖尿病作用，同時(shí)能夠有效預(yù)防四氧嘧啶引起的血糖升高［26］。甜葉菊的抗糖尿病活性主要有3個(gè)途徑:(1)通過抑制肝臟糖異生而表現(xiàn)出阻止血糖升高;(2)甜菊苷、萊鮑迪苷A能夠提高胰島敏感性，刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素，具有安全治療II型糖尿病的作用;(3)甜菊糖苷還可以通過提高小鼠胰島素的利用率而達(dá)到降血糖目的。

2.1.2 降血壓、降血脂作用

研究發(fā)現(xiàn)，甜葉菊葉子提物取具有降血脂［27］以及顯著的降血壓作用［28］，目前發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)理主要是通過抑制Ca2+內(nèi)流入血管細(xì)胞，促使血管擴(kuò)張，從而達(dá)到降血壓作用。

2.1.3 抗菌、抗病毒作用

抑菌圈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甜葉菊葉子乙醇提取物的濃度為1 000 μg/mL時(shí)對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、木糖葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為6、6、6 mm;丙酮提取物的濃度為1 000 μg/mL時(shí)對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、木糖葡萄球菌、反硝化產(chǎn)堿菌、銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑分別為 7、5、6、7、9 mm;甜菊苷在濃度為100 μg/mL時(shí)對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑為分別為 12、10、10、10 mm［29－30］。此外，Kataev 等發(fā)現(xiàn)甜葉菊提取物還具有抗結(jié)核活性［31］，其活性成分為甜菊苷和甜菊雙糖苷，抗結(jié)核MIC值分別為7.5 μg/mL和 3.75 μg/mL［32］。Takahashi等［33］研究發(fā)現(xiàn)，甜葉菊的水提物能夠與人輪狀病毒外衣殼糖蛋白VP7結(jié)合，使VP7與細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)位阻增大，從而阻止病毒依附于正常細(xì)胞，進(jìn)而表現(xiàn)出抗人輪狀病毒的活性。

2.1.4 抗炎作用

甜菊葉的三氯甲烷提取物和甲醇提取物具有顯著的抗炎作用，對角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹有明顯的預(yù)防作用［34］。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)推測，甜菊苷可能是抗炎的活性成分，其作用機(jī)理主要是通過刺激先天性免疫進(jìn)而降低促炎反應(yīng)的發(fā)生［35］。進(jìn)一步的研究證實(shí)，甜菊苷可以抑制NF-κB活性以及蛋白激酶抑制信號傳遞，從而表現(xiàn)出抗炎［36］。Bunprajun等［37］亦發(fā)現(xiàn)，甜菊苷能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB通路信號而提高衛(wèi)星細(xì)胞活性，從而促使受傷肌肉的恢復(fù)。

2.1.5 免疫調(diào)節(jié)

甜葉菊葉子提取物和甜菊醇具有免疫調(diào)節(jié)活性［38］，其作用機(jī)理是通過干擾NF-κB通路而表現(xiàn)出抗炎和較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用［39］。

2.1.6 抗癌作用

Bhattacharyya等［40］研究發(fā)現(xiàn)甜葉菊葉子的乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、水提取物均表現(xiàn)出了抗癌潛質(zhì)。Takahashi等［41］最近報(bào)道，甜菊糖能促進(jìn)Bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)，進(jìn)而釋放到細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此外，Konoshima等［42］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甜菊糖還可以用于預(yù)防化學(xué)致癌。

2.1.7 其他作用

甜葉菊具有抗健忘癥、預(yù)防肥胖癥、預(yù)防心臟病齲齒、殺滅幼蟲、作為飼料改善豬肉的品質(zhì)、治療代謝綜合征等作用。

2.2 安全性研究

甜菊糖作為食品添加劑使用，其安全性尤為重要?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明甜葉菊及甜菊糖食用安全、無毒副作用。Andrey等［43］將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，分別喂食500、1 000和2 000 mg/(kg·d)3種不同劑量的萊鮑迪苷A，持續(xù)90 d，結(jié)果沒有顯示任何毒副作用。Geuns等［44］在肉雞的每個(gè)受精卵中分別注射劑量為 0.08、0.8、4 mg的甜菊苷，或 0.025、0.25、1.25 mg甜菊醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孵化過程中胚胎均發(fā)育正常。Williams等［45］采用艾姆斯實(shí)驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)、骨髓微核試驗(yàn)和DNA合成檢查法證明了萊鮑迪苷A無基因毒性。

3 產(chǎn)品開發(fā)

目前，甜葉菊的產(chǎn)品主要有3大類:(1)甜味劑，其優(yōu)點(diǎn)是甜菊糖苷具有高甜度、低卡熱、安全無毒、物理性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn);(2)輔助藥物，作為輔助品用于糖尿病、高血壓、家禽乳腺炎、牛不孕癥等的治療;(3)飼料、肥料等，主要是將甜菊糖苷生產(chǎn)的工業(yè)廢料添加于動物飼料和農(nóng)作物肥料中，具有調(diào)節(jié)家禽消化功能、提高產(chǎn)蛋率、催促瓜果早熟、瓜果增甜等作用。

甜菊苷作為天然甜味劑，甜度高、卡熱低，具有蔗糖、葡萄糖等常用甜味劑無法比擬的優(yōu)勢，然而卻有嚴(yán)重的苦澀后味。隨著人們對甜菊糖品質(zhì)要求的提高，對于甜菊苷的提取、純化以及口味改善將成為今后的研究熱點(diǎn)，而甜菊糖苷甜味的改善也成為其作為甜味劑進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。

3.1 甜菊糖甜度、甜味以及苦澀后味的影響因素

王德驥［46］從分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度出發(fā)，結(jié)合甜菊糖苷各成分的甜度、甜味，得出了以下結(jié)論:(1)C-13位糖基是甜味主要功能基，一般連有3～4個(gè)糖基的化合物甜度最高、甜味較好，而對甜度、甜味有利的連接糖基種類的順序是果糖＞葡萄糖＞鼠李糖或其它半乳糖基;(2)苷元C-19位酯基是助味基，若連接的不是葡萄糖基如H，則會大大影響甜度和甜味味質(zhì);(3)苷元所具有的強(qiáng)烈苦澀后味是甜菊糖苷苦澀后味的根本原因，所含的雜質(zhì)成分如單寧、類黃酮、倍半萜內(nèi)酯等會增加甜菊糖苷的苦澀味道。

3.2 甜菊糖品質(zhì)改良技術(shù)

3.2.1 復(fù)配法

甜菊糖與其他高卡熱的甜味劑(如蔗糖、葡萄糖等，而以環(huán)糊精糖最為常用)或無機(jī)鹽一起使用時(shí)，甜菊糖的甜度都有較大幅度的提高，而與有機(jī)酸如蘋果酸、酒石酸等混合使用時(shí)則可以改善其苦澀后味。

3.2.2 修飾配糖體

如前文所述，C-13、C-19位的配糖體對甜菊糖各成分的甜度、甜味影響顯著。因此，眾多學(xué)者將研究方向聚焦于對配糖基的改造。目前對甜菊糖苷配糖體改造的方法主要為生物酶催化和微生物轉(zhuǎn)化。通過配糖體的修飾，可以較大程度上改善甜菊糖苷的苦澀后味，同時(shí)甜度也有一定提高。其機(jī)理主要有2點(diǎn):(1)引入了較好的助味糖基(如果糖、葡萄糖)、提高了分子中糖基的比例;(2)生物酶催化具有雙向作用，在催化連接糖基的同時(shí)又有催化糖苷水解的作用，產(chǎn)生的糖(如葡萄糖)能與新產(chǎn)生的糖苷形成“復(fù)配法”的效果。

眾多學(xué)者研究了用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶法(CGTase 法)改造配糖體［47－49］，為目前酶催化改良甜菊糖味質(zhì)研究較為深入的方法，從眾多研究結(jié)果表明此類方法能一定程度上提高甜度、改善甜味，但無論如何優(yōu)化菌種、酶源、底物類型與濃度等影響因素其苷化結(jié)果均表現(xiàn)出低選擇性，如隨著反應(yīng)過程中底物濃度的變化，引入的新糖元會隨之變化，主要包括單糖、雙糖、三糖，如引入新的糖基時(shí)對St糖羥基選擇性差等。也有學(xué)者利用葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)移法改造配糖體［50］，相對CGTase法而言研究較少，它使甜菊糖分子中部分C鏈上重新嫁接了新的葡萄糖基，此方法雖然能直接得到甜菊糖的葡萄糖接枝物，甜菊糖味質(zhì)也得到一定程度改善，但催化活性低，產(chǎn)率低，與此同時(shí)C-13、C-19位連接的部分葡萄糖基亦可能被酶解?？傮w看來，此2類方法選擇性較差、產(chǎn)率低，副產(chǎn)物種類多，而對于這些產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道。

雖然上述酶催化轉(zhuǎn)化法未取得理想的效果，然而在半乳糖苷酶法、β-呋喃果糖苷酶法、微生物轉(zhuǎn)化法等的研究結(jié)果讓我們看到生物酶催化改良甜菊糖苷依然具有可以期待的前景。

Danieli等［51］與朱海霞等［47］采用半乳糖苷酶法改造配糖基，此方法可以高選擇性將半乳糖轉(zhuǎn)移至甜菊糖C-13葡萄糖殘基上，此方法反應(yīng)時(shí)間長、需加入其他輔酶產(chǎn)生供體，且與其他糖基產(chǎn)物相比，半乳糖苷化的ST口感略差。因此，朱海霞等［47］利用在CGTase催化轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中，葡萄糖基是很好的糖基受體，而半乳糖不是的特點(diǎn)，將半乳糖苷酶法和CGTase法結(jié)合使用，先用半乳糖苷酶催化轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，將半乳糖基連接至19位葡萄糖基上，再用該產(chǎn)物作為CGTase催化的底物，這樣就可以選擇性地在13-OH相連的葡萄糖基上進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。

李玉強(qiáng)等［52］用 β-呋喃果糖苷酶法(FFase)在甜菊糖苷和萊鮑迪苷A中引入果糖基，可以使果糖基以 β-2，6糖苷鍵連接至 19-O-β-葡萄糖基的 6-OH上。該方法最優(yōu)催化條件為:pH 6.5，反應(yīng)溫度40℃，并在pH 6～8及40℃以下穩(wěn)定，甜菊苷和甜菊雙糖A苷與蔗糖的摩爾比值為0.000 5和0.001 2，加酶量15 U/mL，反應(yīng)時(shí)間15 h。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，2種糖苷的轉(zhuǎn)化率分別可達(dá)69.4%和72%。除了以上的采用生物酶催化轉(zhuǎn)化的方法改良甜菊糖苷的味質(zhì)，Kusakabe等［53］使用放線菌在甜菊糖苷13-位碳上的2-葡萄糖-β-葡萄糖苷的中間位置轉(zhuǎn)移上了一個(gè)葡萄糖基，成功地使甜葉菊苷轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷A，其轉(zhuǎn)化率約為20%，但其只催化產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)化物，具有高度的專一性。Ishikawa等［54］將微生物菌類與β-呋喃果糖酶結(jié)合使用，在甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的13位碳上轉(zhuǎn)接了β-呋喃果糖。以上研究者所采用的方法選擇性好，產(chǎn)物較為單一，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

一直以來酶法改性甜菊糖是去除其苦澀后味的研究熱點(diǎn)，經(jīng)過20多年來眾多學(xué)者的研究雖未發(fā)現(xiàn)可用于工業(yè)化的生產(chǎn)路線，但生物酶催化轉(zhuǎn)糖苷法和微生物轉(zhuǎn)化法為改良甜菊糖苷甜味的有效途徑的結(jié)論勿容置疑，隨著酶促轉(zhuǎn)糖機(jī)理的研究的不斷深入，有望能夠?qū)崿F(xiàn)從分子層面上對甜菊糖的定向設(shè)計(jì)改造，從而得到更完善的甜菊糖苷類的甜味劑。

3.2.3 改善苷元部分

對苷元部分的改造是一種從根本上改善甜菊糖苷味質(zhì)的方法，目前有關(guān)此方面的報(bào)道較少，主要包括改善苷元的結(jié)構(gòu)和物理包合苷元等方法。Lee Thomas等［55］對甜菊糖苷的苷元和配糖基進(jìn)行了修飾，將苷元上的C-15和C-17位雙鍵轉(zhuǎn)移至C-15和C-16，配糖基選用了葡萄糖、鼠李糖或吡喃木糖，從而提高了甜味，改善了澀味。王德驥等［56］針對甜菊糖苷苦澀味的主要來源苷元部分，通過分析計(jì)算，在提取液、濃縮液中加入環(huán)糊精，對甜菊糖分子的苷元部位進(jìn)行物理包合，所得產(chǎn)物在甜度保持的前提下苦澀后味消失。此方法雖然消除了甜菊糖苷的苦澀后味，卻以犧牲甜菊糖低碳的優(yōu)良屬性為代價(jià)。

4 結(jié)語

近年來，隨著人們健康飲食觀念日益提高，蔗糖、葡萄糖等甜味劑因其高卡熱、易引起幼兒齲齒、不適于糖尿病人使用等缺陷已經(jīng)漸漸無法滿足人們的需求。甜葉菊的主要甜味成分—甜菊糖作為新興的天然甜味劑，具有低卡熱、高甜度、理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全無副作用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、抗菌、抗病毒等重要的生物活性，而使其被譽(yù)為“最有發(fā)展前途的新糖源”。

然而，甜菊糖較為嚴(yán)重的苦澀后味嚴(yán)重影響了其品質(zhì)，也是目前甜菊糖在市場中占有比例較小的重要原因之一。針對這一缺陷，國內(nèi)外眾多學(xué)者從復(fù)配法、精制、結(jié)構(gòu)修飾等方面進(jìn)行了研究，以期得到味道爽口的完美的“甜菊糖”。在眾多的方法中，較為成功的是通過重結(jié)晶、大孔樹脂吸附精制萊鮑迪苷A的方法，并已經(jīng)應(yīng)用到生產(chǎn)中。復(fù)配法改善甜味效果有限，生物酶催化、微生物轉(zhuǎn)化雖然在較大程度上改善了甜味，但其成本較高、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及生物活性不明，且其中有些方法以犧牲甜菊糖的低卡熱的天然優(yōu)勢而達(dá)到改善甜味的目的，如復(fù)配法中采用加入高卡熱的環(huán)糊精、葡萄糖，苷元物理包合法中采用環(huán)糊精作為包合劑等。

將甜菊糖開發(fā)為完美的甜味劑是一條可行、曲折的道路。雖然采用純化精制萊鮑迪苷A在一定程度上改善了甜菊糖產(chǎn)品的品質(zhì)，但是由于萊鮑迪苷A本身也存在一定的苦澀后味，使甜菊糖產(chǎn)品的苦澀后味沒有得到本質(zhì)上的改善，因此筆者認(rèn)為應(yīng)加快生物酶催化、生物轉(zhuǎn)化過程中所產(chǎn)生的新產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定、甜味甜度評價(jià)、安全性研究，以期將此類甜菊糖苷優(yōu)化方法推向工業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)若能發(fā)現(xiàn)甜味甜度更優(yōu)于萊鮑迪苷A的產(chǎn)物，將為今后改造甜菊糖產(chǎn)品的品質(zhì)提供新的、明確的研究方向。

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