螺旋神經(jīng)節(jié)外周投射發(fā)育的體外觀察

孔德秋 黃乃邦 廖輝 敖華飛 阮清偉

哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育早期［小鼠為胚胎期18 天（embrgonic day18，E18）～出生后6 天（postnatal day6，P6）］，螺旋神經(jīng)節(jié)（spiral ganglion neurons，SGN）外周纖維通過生長(zhǎng)、純化、退縮及突觸剪切等一系列過程來消除不合適分支，形成與毛細(xì)胞之間特定的突觸連接，構(gòu)成耳蝸音頻定位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，螺旋神經(jīng)節(jié)這種外周靶支配可能受多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF、NT－3）和細(xì)胞外基質(zhì)的影響［2，3］，并且在體研究存在實(shí)驗(yàn)干預(yù)、解剖操作困難等諸多不便，因此，需要建立一種體外螺旋神經(jīng)節(jié)支配模型作為在體研究的有益補(bǔ)充，而體外培養(yǎng)時(shí)，螺旋神經(jīng)節(jié)樹突是否還能像在體時(shí)一樣生長(zhǎng)發(fā)育，特別是體外I型和II型螺旋神經(jīng)節(jié)傳入周圍投射的發(fā)育目前還沒有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外培養(yǎng)胚胎小鼠Corti器，觀察兩型螺旋神經(jīng)節(jié)外周投射的發(fā)育過程，比較其與在體發(fā)育的異同，從而建立螺旋神經(jīng)節(jié)體外支配模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年C57BL／6小鼠12對(duì)作為種鼠，體重25～35g，由上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。晚8點(diǎn)合籠，次晨8點(diǎn)可見陰栓即確定為受孕第1天，小鼠的平均孕期為18～21天。選胚胎第16天（E16）小鼠18只，共取36只Corti器，分為三組，每組12只，分別體外培養(yǎng)2、3、4天，另選4只出生當(dāng)天（P0）小鼠的8只Corti器，一起行免疫組織化學(xué)染色。

1.1.2 主要試劑和儀器 ①膠原凝膠液（即鼠尾膠，Collagen I，Rat Tail，GIBCO 公司）即以0.02N醋酸加50×膠原溶液（N Acetic Acid 7.8μl ＋Collagen 130μl＋H2O 6.3ml）為A 液，10×Eagle培養(yǎng)基溶液為B 液，2%碳酸鈉溶液為C 液，按A ：B：C＝9：1：1比例配成；②無血清培養(yǎng)液（Serum—Free Medium），即小牛血清蛋白（BSA）2g，Serum－Free Supplement 2ml，2%葡萄糖4.8ml，青霉素G 0.4ml，200mM 谷氨酰胺2ml，1×BME 190.8 ml；③Neuronal Classβ－Tubulin（TUJ1）Rabbit Monoclonal Antibody lgG2a（1：2 000），Covance公司；④Rabbit anti－peripherin polyclonal antibody（1：00），Chemicon 公司；⑤conjugated goat antirabbit IgG （1：100），F(xiàn)ITC anti－mouse lgG2a（1：100），rhodamine－phalloidin（1：150）均購自Bio－Legend 公司；⑥共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2 AOBS，Germany）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳蝸基底膜組織培養(yǎng) 取膠原凝膠液（按A：B：C＝9：1：1的比例）滴人直徑35毫米的培養(yǎng)皿中，待1刻鐘左右溶液出現(xiàn)凝膠化之后，加入無血清培養(yǎng)液，加入的液體量以剛好浸過膠原滴為止。按照確定的日期，對(duì)懷孕16天的小鼠全麻（苯妥英納，90mg／kg）下剖腹取出胚胎，置入預(yù)冷的無菌Hanker液中，移入超凈工作臺(tái)，剪開其顱腔，去除腦組織，暴露顱底，分離雙側(cè)顳骨，在放大20～40倍解剖顯微鏡下，依次剝離外耳道周圍、耳蝸表面組織；用尖鑷挑開耳蝸外的軟骨壁，暴露基底膜，盡可能完整的將含有螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和毛細(xì)胞的基底膜從蝸軸上分離出來，將其移人無血清培養(yǎng)液中，再逐步將其移到膠原凝膠滴的中央表面鋪放平整，盡量使基底膜片段的凹面向下鋪在膠原滴上。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入2ml培養(yǎng)液，此后培養(yǎng)液2 天換一次。每日在倒置顯微鏡下觀察Corti器組織的形態(tài)變化及附壁情況，選擇形態(tài)和附壁良好的Corti器作為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)2、3、4 天后分別終止培養(yǎng)，各組可用Corti器分別為8、7和8只。

1.2.2 耳蝸基底膜免疫熒光染色 將出生當(dāng)天的4只小鼠頸椎脫臼處死后浸于4 ℃75%酒精中消毒5min，無菌條件下取出顳骨，置入預(yù)冷的無菌Hanker液中。在放大20～40倍解剖顯微鏡下，打開聽泡，剔除耳蝸骨殼及周圍結(jié)締組織，暴露基底膜，將含有螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和毛細(xì)胞的8只基底膜從蝸軸上分離出來，浸泡在4 ℃、4% 甲醛溶液中固定2小時(shí)以上；再從37 ℃溫箱中取出體外培養(yǎng)的表面覆蓋有膠原凝膠的基底膜，在4 ℃、4% 甲醛溶液中固定2小時(shí)以上，用細(xì)鑷沿培養(yǎng)皿的底部刮脫培養(yǎng)皿中帶有基底膜的膠滴，所有標(biāo)本用PBS洗滌3×5min；0.1%Triton X 一100處理15min，5%goat serum 封閉2～3小時(shí)；根據(jù)不同的顯色要求加入一抗：β－Tubulin（TUJ1）抗體（1：2 000）、anti－peripherin抗體（1：1 000），混和5%goat serum＋0.25%Triton X－100 ＋0.1M PBS，室溫孵育過夜，PBS洗滌3×15 min；加入二抗：FITC conjugated goat anti－rabbit IgG （1：100），F(xiàn)ITC antimouse lgG2a（1：100），室溫避光放置2小時(shí)。毛細(xì)胞染色rhodamine－phalloidin（1：150），室溫15 min。PBS洗滌3×15min，輕輕搖動(dòng)，蓋玻片封片。

1.2.3 影像采集和分析 免疫熒光染色后的基底膜切片置于LSCM 倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，選共聚焦專用平場(chǎng)復(fù)消色差20×、40×鏡頭，熒光標(biāo)記用波長(zhǎng)494nm／518nm，外毛細(xì)胞頂部至螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域自上而下以0.5μm 的層距進(jìn)行連續(xù)掃描，獲取清晰二維圖像，圖像存為1 024×1 024像素類型。

2 結(jié)果

2.1 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突向外生長(zhǎng)并支配毛細(xì)胞 胚胎16天（E16）小鼠Corti器體外培養(yǎng)2天，可見螺旋神經(jīng)節(jié)散在分布，SGN 分布區(qū)內(nèi)纖維交織成叢，稱為螺旋節(jié)內(nèi)束，TUJ1 標(biāo)記的神經(jīng)纖維數(shù)量多，且之間相互交叉，向外呈放射狀生長(zhǎng)，越過內(nèi)毛細(xì)胞，到達(dá)外毛細(xì)胞區(qū)域并發(fā)出分支（圖1a、b）；peripherin染色的II型神經(jīng)突同樣越過內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)，到達(dá)相當(dāng)于外毛細(xì)胞分布區(qū)（圖1c），但是圖1c中到達(dá)外毛細(xì)胞區(qū)的纖維數(shù)量和圖1a、b相比明顯減少，可知圖1a、b中到達(dá)外毛細(xì)胞區(qū)的神經(jīng)突中包含部分的I型神經(jīng)纖維。

2.2 放射束和內(nèi)螺旋叢形成 E16天小鼠Corti器體外培養(yǎng)3天（圖2、3），從SGN 發(fā)出的外周纖維聚集成多條間隔明顯的放射狀神經(jīng)束，內(nèi)含多條神經(jīng)纖維，束與束之間的交叉減少（與圖1比較），內(nèi)毛細(xì)胞基底外側(cè)部接受來自不同神經(jīng)束的纖維支配，交叉形成內(nèi)螺旋叢，越過螺旋隧道的纖維到達(dá)外毛細(xì)胞，生長(zhǎng)迅速，沿線性分布的外毛細(xì)胞延伸，不同行的纖維之間互相交叉，同時(shí)可見纖維向耳蝸底回彎曲。

2.3 內(nèi)、外螺旋束形成 E16天小鼠Corti器體外培養(yǎng)4天（圖4）和體外培養(yǎng)3天Corti器相比，SGN排列更加緊密，毛細(xì)胞下游的外周纖維數(shù)量減少，神經(jīng)束間隔加大，束間的纖維交叉更加稀少。神經(jīng)束底端連接SGN，頂端連接內(nèi)毛細(xì)胞，并且一個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞主要由一條神經(jīng)束發(fā)出的纖維支配，在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)形成內(nèi)螺旋束。到達(dá)外毛細(xì)胞的纖維明顯減少，不同行之間的纖維交叉減少，與在體發(fā)育Corti器的三條清晰外螺旋束相比，此時(shí)為不完全外螺旋束。

2.4 螺旋神經(jīng)節(jié)外周投射體外與在體發(fā)育比較 出生當(dāng)天小鼠（P0）Corti器一排內(nèi)毛細(xì)和三排外毛細(xì)胞排列緊密（圖5a），內(nèi)、外螺旋束清晰（圖5c），毛細(xì)胞和神經(jīng)突呈對(duì)應(yīng)關(guān)系（圖5e）；體外培養(yǎng)3天的Corti器中，毛細(xì)胞排列緊密，但有少量增生（圖5b），外螺旋束存在少量分支（圖5d），形態(tài)不規(guī)則，毛細(xì)胞和螺旋束之間保持對(duì)應(yīng)關(guān)系。與P0 相比，體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)樹突總體上保持了相同的靶支配模式。

3 討論

在活體內(nèi)，小鼠妊娠期通常為18～21 天，E10時(shí)，SGN 剛可以被辨認(rèn)出；E13～E15，SGN 外周纖維到達(dá)聽覺上皮內(nèi)；E16，毛細(xì)胞開始分化，大部分纖維停留在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)，少量纖維穿過螺旋隧道到達(dá)外毛細(xì)胞，在整個(gè)妊娠期，SGN 樹突都呈放射狀生長(zhǎng)，無彎曲轉(zhuǎn)向；P0時(shí)，外周纖維生長(zhǎng)迅速，橫穿整個(gè)外毛細(xì)胞區(qū)，并向底回彎曲生長(zhǎng)；P2時(shí)，三條清晰的外螺旋束形成，之后內(nèi)螺旋束才逐漸出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用鼠尾膠體外培養(yǎng)Corti器［4，5］，利用β－Tubulin抗體特異性顯示I型和II型SGN 及其樹突、peripherin抗體標(biāo)記II型SGN 及其樹突、phalloidin示蹤毛細(xì)胞，直觀的展現(xiàn)了螺旋神經(jīng)節(jié)樹突體外發(fā)育的過程，結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)2天，兩型SGNs樹突向外周生長(zhǎng)延伸，同時(shí)支配內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞，與以往在體E18時(shí)觀察到的SGNs發(fā)育一致［6］，體外培養(yǎng)3天，相當(dāng)于在體P0期，SGN 外周纖維聚集成束，在內(nèi)毛細(xì)胞基底外側(cè)面交織形成內(nèi)螺旋叢，越過Corti器的纖維沿外毛細(xì)胞向底回彎曲生長(zhǎng)；體外培養(yǎng)4天，與在體P1～P2時(shí)間相對(duì)應(yīng)［7］，SGN 外周纖維進(jìn)一步退縮、純化，消滅部分螺旋神經(jīng)節(jié)與外毛細(xì)胞間突觸，形成內(nèi)螺旋束和帶分支的外螺旋束?？梢?，體外培養(yǎng)的Corti器神經(jīng)投射，除了內(nèi)螺旋束的形成提前外，基本上保持了與在體相同的外周投射發(fā)育。分析原因可能為，內(nèi)、外螺旋束的形成是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程，它們與毛細(xì)胞的分化成熟密切相關(guān)，毛細(xì)胞分化成熟的早晚決定了內(nèi)、外螺旋束的形成時(shí)間。最終，內(nèi)毛細(xì)胞由I型耳蝸神經(jīng)節(jié)支配，而外毛細(xì)胞由II型感覺神經(jīng)元支配。每個(gè)I型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞僅與一個(gè)單獨(dú)的內(nèi)毛細(xì)胞相接觸，約15～20個(gè)I型耳蝸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為一個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞向中樞提供平行的通道，但每個(gè)II型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外螺旋纖維在行進(jìn)中支配約30～60個(gè)外毛細(xì)胞，由數(shù)目很少的II型耳蝸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向中樞提供很多外毛細(xì)胞整合的信息［8］。

Sobkowicz等［9］曾利用雙蓋玻片裝置（maximow slide assembly）加動(dòng)物血清體外培養(yǎng)小鼠Corti器，全基底膜銀染，胞內(nèi)注射辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記細(xì)胞，電子顯微鏡下觀察SGN 外周投射模式的發(fā)展變化，其過程較復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)將Corti器平鋪在多孔培養(yǎng)皿中的鼠尾膠內(nèi)培養(yǎng)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)基用的是去血清營(yíng)養(yǎng)液，化學(xué)成分固定，排除了影響神經(jīng)生長(zhǎng)的外在因素，并可根據(jù)需要改變培養(yǎng)條件。免疫組織化學(xué)染色相對(duì)銀染和HRP染色來說，特異性強(qiáng)，可以區(qū)分I型和II型螺旋神經(jīng)節(jié)纖維發(fā)育的不同階段。但本實(shí)驗(yàn)同時(shí)存在以下不足：TMRD （tetramethylrhodamine－conjugated dextran）可以特異性的示蹤I型SGNs及其樹突，有效的將兩型神經(jīng)突區(qū)別開來，但是其染色必須涂在神經(jīng)纖維新鮮的斷面上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)剛?cè)∠碌呐咛ナ蠖亼?yīng)用TMRD 染色，培養(yǎng)后鏡下顯示只有I型SGNs胞體著色，分析原因可能為：①TMRD 對(duì)新生神經(jīng)纖維產(chǎn)生毒性，使神經(jīng)纖維退縮消失；②浸泡在培養(yǎng)液中的Corti器，TMRD 被稀釋，不足以染色神經(jīng)遠(yuǎn)端；③隨著纖維的增長(zhǎng)，I 型SGNs 吸收的TMRD 相對(duì)不足，從而無法染色。所以本實(shí)驗(yàn)不能對(duì)I型SGNs樹突單獨(dú)染色，如何利用TMRD 或其它染色劑示蹤體外培養(yǎng)的I型SGNs樹突還有待進(jìn)一步研究。

圖1 E16小鼠Corti器體外培養(yǎng)2天螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突向外生長(zhǎng)并支配毛細(xì)胞 a、b、TUJ1染色（綠色），顯示兩型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維（×20）；c，peripherin染色（綠色），顯示II型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維（×40）。RF（radial fibers）：放射纖維；OHCR（out hair cell region）：外毛細(xì)胞區(qū)；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞圖2 E16小鼠Corti器體外培養(yǎng)3天全基底膜鋪片 TUJ1染色（綠色）（×20），顯示兩型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維。HC（hair cell），毛細(xì)胞；RF（radial fibers）：放射纖維；SGN（spiral ganglion neurons）：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；CAI（central afferent innervations）：中央傳入投射圖3 E16小鼠Corti器體外培養(yǎng)3天放射束和內(nèi)螺旋叢形成 a，b，TUJ1染色（綠色）（圖a×40，圖b×20），顯示兩型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維。ISP（inner spiral plexus）：內(nèi)螺旋叢；OSB（outer spiral bundles）：外螺旋束；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞圖4 E16小鼠Corti器體外培養(yǎng)4天內(nèi)、外螺旋束形成 a，b，c，d，TUJ1染色（綠色）（a，b×20，c，d×40），顯示兩型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維。ISP（inner spiral plexus）：內(nèi)螺旋叢；OSB（outer spiral bundles）：外螺旋束；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞圖5 E16小鼠Corti器體外培養(yǎng)3天（圖b、d、f）和出生當(dāng)天（P0）（圖a、c、e）毛細(xì)胞和SGNs樹突的發(fā)育 a，b，phalloidin染色（紅色），圖中顯示毛細(xì)胞；c，d，peripherin染色（綠色），顯示II型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和纖維；e，f分別為圖a，c和圖b，d疊加后的圖像，×20

總之，本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)的帶Rosenthal隧道的基底膜，SGNs保持了與在體發(fā)育相同的外周靶支配模式。在此模型中，傳出纖維和SGN 軸突缺失，大部分SGN 外周纖維還沒到達(dá)毛細(xì)胞，因而可以作為一個(gè)專門研究螺旋神經(jīng)節(jié)樹突發(fā)育的替代模型。

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