不同釀造工藝對兩性花毛葡萄NW196葡萄酒揮發(fā)性物質的影響

劉 晶，李 華,2，陶永勝,2，張 莉,2，王 華,2,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

兩性花毛葡萄NW196是以東亞種野生毛葡萄為母本，歐亞種釀酒葡萄品種“粉紅玫瑰”為父本經遠緣雜交選育出的兩性花雜交種后代[1]。該品種葡萄具有著果率高、豐產穩(wěn)產、抗病性較強等特點，果實品質及釀酒性能均優(yōu)于原野生毛葡萄而又能保持原特色[2]，且其能利用南方氣候條件優(yōu)勢正常生產出一年兩熟葡萄，二茬果一般在11月下旬成熟，有效調節(jié)了葡萄釀造加工原料供應期，深受釀造加工企業(yè)的歡迎[3]。

葡萄酒香氣是構成葡萄酒產品感官質量的重要方面，能夠體現葡萄酒的感官特征和典型性[4]。目前，在葡萄酒中已經鑒定出1000多種風味化合物，這些化合物除了來源于葡萄果實以外，絕大部分來源于酵母菌的酒精發(fā)酵過程[5]，因此釀造工藝對葡萄酒中揮發(fā)性成分的組成及其含量具有重要影響。目前葡萄酒釀造中使用的方法有連續(xù)發(fā)酵法、旋轉罐發(fā)酵法、熱浸漬工藝和CO2浸漬發(fā)酵等，其中CO2浸漬釀造法是將整粒葡萄漿果置于充滿CO2的密閉容器中首先進行細胞內發(fā)酵，然后在進行酒精發(fā)酵，所釀制的葡萄酒色澤鮮艷，香氣濃郁，口味豐滿柔和，具有純凈優(yōu)雅爽悅的口感，且酸度低、成熟快，富有新鮮悅人的果香味與醇美協調的酒香味，具有獨特的風格[6-7]。

目前我國葡萄酒生產中普遍采用歐亞種葡萄，有關該種葡萄及其所釀酒中揮發(fā)性成分的研究較多[8-10]，但對我國特有的野生毛葡萄及其雜交種所釀葡萄酒揮發(fā)性物質的研究較少。本研究利用氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)儀對4種工藝釀造的兩性花毛葡萄NW196干紅葡萄酒中的揮發(fā)性物質進行測定，分析CO2浸漬工藝和蘋果酸乳酸法對其種類和含量的影響，旨在為充分開發(fā)利用野生毛葡萄及其雜交種葡萄種質資源、釀造我國特色葡萄酒提供建議和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩性花毛葡萄NW196葡萄一茬果，2011年7月15日采收于廣西省河池市都安瑤族自治縣。原料含糖量為178.4g/L，含酸量(以酒石酸計)為14.05g/L。

乙醇、二氯甲烷均為色譜純；無水硫酸鈉、硫酸鎂為分析純；2-辛醇(標樣)。

1.2 儀器與設備

Thermo Finnigan TRACE DSQ氣相色譜-質譜-計算機聯用儀 美國Finnigan公司；SENCO W20薄膜旋轉蒸發(fā)儀 上海申生科有限公司；SHB-111真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；純水機 英國Millipore公司；超聲波萃取儀、磁力攪拌器等。

1.3 方法

1.3.1 釀酒工藝

葡萄采收后按照4種工藝釀造NW196干紅葡萄酒：(1)傳統工藝(196CK)：參照西北農林科技大學葡萄酒學院“小容器釀造規(guī)范”，酒精發(fā)酵結束后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵[7]；(2)CO2浸漬釀造工藝(196CK＋MLF)：葡萄→分選→整穗入罐(通入CO2，加入SO260mg/L)→厭氧浸漬(15d、30～35℃，每隔1d補充CO2)→分離壓榨→酒精發(fā)酵(18～20℃)→發(fā)酵中止，分離→倒罐→低溫貯藏[11]；(3)傳統工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵(196MC)：按傳統工藝酒精發(fā)酵結束后，經蘋果酸乳酸發(fā)酵，然后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵，分離→倒罐→低溫貯藏；(4) CO2浸漬釀造工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵(196MC＋MLF)：按CO2浸漬工藝酒精發(fā)酵結束后，經蘋果酸乳酸發(fā)酵，然后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵，分離→倒罐→低溫貯藏。

1.3.2 樣品制備

取50mL酒樣加入到100mL具塞錐形瓶中，添加20μL 2-辛醇乙醇溶液(500mg/L，內標物)，2g MgSO4粉末和20mL二氯甲烷，錐形瓶加蓋密封。置冰浴中，在磁力攪拌器上攪拌萃取(500r/min)1h，混合物經超聲波超聲15min(25℃)，去除乳化現象，收集有機相，無水Na2SO4脫水，有機相濾紙過濾，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1mL，供GC-MS上機分析。每個樣品的揮發(fā)性成分萃取操作做3次重復[12-13]。

1.3.3 色譜條件

色譜條件：色譜柱RtxR25 MS(15m×0.25mm，0.25μm)；樣口溫度為260℃，柱溫箱起始溫度60℃，保留時間2.5min，以6℃/min升溫至240℃，保留15min；載氣He，流速1mL/min；分流比80：1，進樣量1μL。

質譜條件：電子電離(electron inoization，EI)方式，電離電壓70eV，離子源溫度200℃，連接桿溫度260℃。

1.3.4 揮發(fā)性成分的定性定量分析

定性分析：樣品總離子流圖中色譜峰定性采用氣相色譜-質譜聯用儀隨機所帶NIST 2.0譜庫和Willey譜庫檢索，結合相關文獻保留指數比對確認[14]。

定量分析：采用2-辛醇內標法進行半定量，計算公式如下[14]：

檢測物質濃度=(檢測物質峰面積/2-辛醇峰面積)×2-辛醇濃度

2 結果與分析

2.1 干紅葡萄酒揮發(fā)性物質的GC-MS檢測結果

圖 1 4種葡萄酒中揮發(fā)性物質GC-MS總離子圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds in wine made by four different processes

使用GC-MS對4種工藝釀造的NW196干紅葡萄酒的揮發(fā)性成分進行分析，總離子圖見圖1，利用NIST02版本圖譜檢索進行檢索，鑒定出的各揮發(fā)性物質的種類和含量見表1。檢索結果表明，傳統工藝釀造的NW196干紅葡萄酒(196CK)經GC-MS分析，分離出45個峰，鑒定出40種揮發(fā)性物質，包括12種醇(258.52mg/L)、19種酯(51.28mg/L)、5種酸(9.49mg/L)、3種酮(2.08mg/L)和1種酚(0.29mg/L)。傳統工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵的NW196干紅葡萄酒(196CK＋MLF)分離出50個峰，鑒定出42種揮發(fā)性物質，包括12種醇(293.56mg/L)、17種酯(43.37mg/L)、6種酸(10.34mg/L)、3種酮(3.14mg/L)、2種酚(2.14mg/L)、1種酸酐(0.33mg/L)和1種含氮化合物(0.15mg/L)。CO2浸漬工藝釀造的NW196干紅葡萄酒(196MC)分離出47個峰，鑒定出42種揮發(fā)性物質，包括14種醇(243.81mg/L)、18種酯(61.96mg/L)、6種酸(12.23mg/L)、1種酮(1.11mg/L)、2種酚(3.63mg/L)和1種含氮化合物(1.04mg/L)。CO2浸漬工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵的NW196干紅葡萄酒(196MC＋MLF)分離出54個峰，鑒定出45種揮發(fā)性物質，包括13種醇(294.17mg/L)、17種酯(51.90mg/L)、8種酸(19.59mg/L)、3種酮(2.67mg/L)、3種酚(7.78mg/L)和1種酸酐(0.31mg/L)。

2.2 醇類物質的分析

葡萄酒中的醇類主要來源于酒精發(fā)酵、氨基酸轉化及亞麻酸降解物的氧化[15]。由表1可知，4種工藝釀造的葡萄酒中醇類物質均占主要部分，共檢測到16種醇類，其中有8種是4種酒所共有的，它們是：丙醇、2-甲基-1-丙醇、丁醇、3-甲基-1-丁醇、L-(＋)-2,3-丁二醇、3-(甲硫基)-1-丙醇、苯甲醇和苯乙醇。從醇類物質的總含量上來看，均是進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒比未經此發(fā)酵的葡萄酒中高，如196CK＋MLF酒樣比196CK酒樣中醇類含量高35.04mg/L，196MC＋MLF酒樣比196MC酒樣高50.36mg/L，這說明蘋果酸乳酸發(fā)酵可以增加酒樣中醇類物質的含量，但并未豐富其種類，只有196MC酒樣中有14種醇類，其他酒樣中分別為12、12和13種。4種酒樣中，含量最高的兩種物質均是異戊醇和苯乙醇，說明這兩種醇類物質是NW196干紅葡萄酒中的主要物質。此外，3-戊醇和2-甲基-6-庚烯-1-醇只在傳統工藝葡萄酒中發(fā)現，而3-乙氧基-1-丙醇、3-苯丙醇和6-甲基-5-庚烯-2-醇僅在CO2浸漬葡萄酒中檢測到，其中以3-苯丙醇在兩組酒樣中的含量差異最為明顯，在傳統工藝葡萄酒中沒有檢測到，而在CO2浸漬葡萄酒中分別高達1.74mg/L和2.26mg/L，這說明不同的釀造工藝對葡萄酒中醇類物質的種類具有重要的影響。

表 1 4個酒樣中醇類化合物的含量Table 1 Contents of alcohol compounds in four samples

2.3 酯類化合物的比較及分析

表 2 4個酒樣中酯類化合物的含量Table 2 Contents of ester compounds in four samples

酯類物質是葡萄酒中重要的芳香物質之一，絕大多數酯類使葡萄酒形成愉快的香氣[16-17]。由表2可知，4種葡萄酒中共檢測到24種酯類化合物，其中有10種是4種酒共有的。酯類物質總含量的變化規(guī)律表現為CO2浸漬發(fā)酵的葡萄酒比傳統工藝發(fā)酵的葡萄酒中酯類含量高，如196MC酒樣中酯類含量比196CK酒樣多10.68mg/L，196MC＋MLF酒樣比196CK＋MLF酒樣多8.53mg/L；但進行了蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒中酯類物質的含量卻比未經此發(fā)酵的葡萄酒中低，這表明CO2浸漬能夠使葡萄酒酯類香氣更加濃郁，同時也說明浸漬工藝對葡萄酒中酯類物質含量的影響比是否進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的影響更大。此外，196CK酒樣中含量較高的酯類有丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、1,3-丙二醇二乙酸酯和4-羥基丁酸乙酰酯；196CK＋MLF酒樣中含量較高的酯類為丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、4-羥基丁酸乙酰酯、1,3-丙二醇二乙酸酯和乙酸異戊酯；196MC酒樣中含量較高的酯類分別為：丁二酸乙酯、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、亞油酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯和油酸乙酯，196MC＋MLF酒樣中含量較高的酯類為丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、4-羥基丁酸乙酰酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯。癸酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯是CO2浸漬葡萄酒中特有的，而1,3-丙二醇二乙酸酯、1,4-丁二醇二乙酸酯和羥基丁二酸二乙酯僅在傳統工藝葡萄酒中發(fā)現。甲酸己酯和乙酰甘氨酸乙酯僅在196CK＋MLF酒樣中檢測到，與此相反，油酸乙酯、亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯只存在于其他3種酒樣中，并且在196MC酒樣中的含量顯著多于其他酒樣，其含量分別為3.94、7.15mg/L和2.93mg/L。

2.4 酸類化合物的分析

表 3 4個酒樣中酸類化合物的含量Table 3 Contents of acid compounds in four samples

由表3可知，4種酒樣中酸類化合物的含量都比較高，這是由于NW196葡萄本身酸度就比一般釀酒葡萄高很多的原因。一般研究結果表明[18-21]，和傳統工藝對比，CO2浸漬工藝葡萄酒中總酸含量明顯降低，而本實驗在CO2浸漬葡萄酒中檢測到的羧酸物質總含量比傳統工藝葡萄酒中的高，推測總酸降低的原因為其他酸類大幅度降低，其原因有待于進一步探索。另外，進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒中羧酸物質的總含量均比未經此發(fā)酵的葡萄酒中高，如196CK＋MLF酒樣中酸類含量比196CK酒樣多0.85mg/L，196MC＋MLF酒樣中比196MC酒樣多7.36mg/L。4種酒中共檢測到11種酸類化合物，其中有4種是4種酒所共有的，它們是：己酸、辛酸、癸酸和2-甲基丙酸，但它們在每種酒樣中的含量有所不同。2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和2-甲基己酸分別于不同離子圖中同一出峰時間檢測到，說明同一葡萄原料采用不同的釀造工藝可以產生結構不同的物質，這些低級脂肪酸都具有明顯的脂肪味，對NW196干紅葡萄酒的整體結構具有重要作用。棕櫚酸、9-癸烯酸和甲羥丙二酸只在196MC＋MC酒樣中檢測到，其中棕櫚酸是弱極性化合物，呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香，對于干紅葡萄酒的味感平衡具有調節(jié)作用[22]。

2.5 其他化合物的分析

表 4 4個酒樣中其他類化合物的含量Table 4 Contents of other compounds in four samples

由表4可知，4種酒樣中共檢測到5種酮類化合物，其中只有2-辛桐為其共有。從酮類總量上來看，均是進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒樣中比未經此發(fā)酵的含量高。4-甲氧基-3-羥基苯乙酮和2,3-戊二酮只存在于傳統葡萄酒中，且進行蘋乳發(fā)酵的酒中比未經此發(fā)酵的分別高0.78mg/L和0.43mg/L；而4-甲氧基-2-羥基苯乙酮只在196MC＋MC酒樣中檢測到，且該物質與傳統葡萄酒中的4-甲氧基-3-羥基苯乙酮僅在羥基的位置上發(fā)生變化，說明釀造工藝可影響香氣成分的結構。在4種葡萄酒中還檢測到4種酚、1種酸酐和1種含氮化合物。在兩種傳統葡萄酒中檢測到3-乙基苯酚，而在CO2浸漬葡萄酒中則發(fā)現4-乙基苯酚，且后者含量顯著比前者高，再次表明釀造工藝對香氣成分的結構和含量均有重要影響。苯酚僅在196MC＋MC酒樣中檢測到，而4-乙基-2-甲氧基苯酚出現在除了196CK酒樣外的其他3種酒樣中。戊烯二[酸]酐僅在經過蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒樣中(196CK＋MLF和196MC＋MLF)檢測到，且其在兩者中含量差別不大。此外，在196CK＋MLF和196MC 酒樣中均檢測到N-乙基乙酰胺。

3 結論與討論

本研究分析了CO2浸漬工藝和蘋果酸乳酸發(fā)酵對NW196干紅葡萄酒中揮發(fā)性成分的影響，各酒樣中揮發(fā)性物質總含量的大小順序為：196MC＋MLF＞196CK＋MLF＞196MC＞196CK。和傳統葡萄酒相比，CO2浸漬酒中酮類物質的含量相對較低，但是酯類、酸類和酚類等物質的含量以及揮發(fā)性物質種類總數和總含量均表現出不同程度的上升，如196MC酒樣中酯類含量較196CK酒樣增加了20.80%，196MC＋MLF酒樣中酯類含量較196CK＋MLF酒樣增加了19.68%，這表明CO2浸漬處理能夠豐富葡萄酒中的揮發(fā)性物質。對于蘋果酸乳酸發(fā)酵，雖然此發(fā)酵的進行沒有增加葡萄酒中酯類物質的種類和含量，但其顯著增加了酒中醇類、酸類、酮類、酚類等物質的含量以及揮發(fā)性物質種類總數和總含量，所以完成蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒比酒精發(fā)酵終止酒揮發(fā)性成分更加復雜。在兩種CO2浸漬葡萄酒中檢測到了9-十六碳烯酸乙酯和具有水果香味的癸酸乙酯[23-24]，在進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的CO2浸漬葡萄酒中檢測到了丙酮酸異戊酯、棕櫚酸、9-癸烯酸、苯酚和2-羥基-4-甲氧基苯乙酮等物質，而且CO2浸漬葡萄酒和傳統工藝釀造的葡萄酒所共有的揮發(fā)性物質含量也有很大不同，這些都說明CO2浸漬處理產生的葡萄酒中揮發(fā)性成分差異性是非常明顯的，不同的釀造工藝能夠使同一葡萄原料釀造出不同風格的葡萄酒，這對于改善葡萄酒市場產品同一化嚴重的現象提高了很好的思路，將CO2浸漬特殊釀酒工藝結合蘋果酸乳酸發(fā)酵應用到我國特有的兩性花毛葡萄酒的釀造中，能夠為葡萄酒市場提供更具特色的葡萄酒。當然，葡萄酒的香氣質量不僅取決于揮發(fā)性物質的種類和含量，還與其感覺閾值和各成分之間相互作用密切相關，所以應該結合感官品評等方面綜合考察CO2浸漬工藝對NW196干紅葡萄酒質量的影響。

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