趙瀛 黃斐 宋斌斌 郭瑋 潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的系統(tǒng)性慢性自身免疫性疾病，主要臨床特征為對稱性、反復(fù)性多滑膜關(guān)節(jié)炎，最終可導(dǎo)致不可逆的骨關(guān)節(jié)損傷。RA的早期診斷、治療對提高患者的生活質(zhì)量和生存率有重要意義。1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(American Rheumatism Association，ACR)首次制定了RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征以及類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)測定等方面，但是，RA患者在達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)時可能早已發(fā)生骨關(guān)節(jié)損傷。此外，RF也可見于其他自身免疫性疾病、慢性感染患者或老年人的血清中，因此其用于診斷RA的特異性較差。2009年ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)提出，將抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體納入RA的新的診斷標(biāo)準(zhǔn)中。

抗-CCP抗體是由RA患者的B淋巴細(xì)胞分泌的一種特異性較高的自身抗體，不僅可作為鑒別診斷RA與其他風(fēng)濕病所致關(guān)節(jié)炎(痛)的指標(biāo)[1-3]，還可作為判斷RA患者骨關(guān)節(jié)損傷程度以及評估療效的指標(biāo)[4-5]。目前，在抗-CCP抗體的靶抗原、包被方式和固相載體、檢測技術(shù)等方面都有了長足發(fā)展。

1 抗-CCP抗體特異性靶抗原

1998年，Schellekens等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中的瓜氨酸肽是與自身免疫抗體結(jié)合的最主要的抗原決定簇，且聚角蛋白中富含的精氨酸的羧基端具有抗原性。由此，研究人員從人工合成的氨基酸序列中篩選出線性多肽，以此作為靶抗原。該靶抗原序列已知，可大量合成并純化，而且分子量較小，與血清中其他成分的非特異性反應(yīng)較少。但是，此類靶抗原的線性構(gòu)象不穩(wěn)定，可能產(chǎn)生“構(gòu)象稀釋”效應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。

在抗原抗體復(fù)合物中，抗原肽常常以β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象形式存在。2000年，Schellekens等[7]以胱氨酸替代絲氨酸作為橋聯(lián)介質(zhì)，使線性瓜氨酸肽環(huán)化即轉(zhuǎn)化為CCP，以此模仿自然的抗原決定簇，使其在溶液中的構(gòu)象更為穩(wěn)定；隨后，他們通過Fmoc化學(xué)法固相合成含21個氨基酸序列的CCP，即第1代CCP(CCP1)，以CCP1作為靶抗原，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測RA患者血清中的抗-CCP抗體；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與線性瓜氨酸肽比較，CCP診斷RA的靈敏度提高(68% 比 49%)，特異度為98%，但是CCP的靈敏度較RF略低[8]。2002年第2代CCP(CCP2)問世，CCP2是從RA患者的血清環(huán)瓜氨酸庫中篩選出的不同系列、反應(yīng)性較好、模擬真實構(gòu)象的抗原肽[9]。CCP2的檢測性能較CCP1好，CCP2診斷RA的靈敏度為64.4%～96%，已成為臨床實驗室中較為常用的抗原肽之一[10]。ELISA法檢測顯示，CCP2的診斷靈敏度(67.4%)高于CCP1(46.5)[11]。van Gaalen等[9]發(fā)現(xiàn)，CCP2不僅可用于診斷早期RA，還可以預(yù)測RA患者關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)展。CCP3是一種重組多肽，包含多種構(gòu)象的瓜氨酸表位，從而增加了暴露位點，提高了對早期RA的免疫反應(yīng)性[12]。dos Anjos等[13]對同一廠家生產(chǎn)的第2、3代抗-CCP抗體比較后發(fā)現(xiàn)，CCP3的診斷特異性與CCP2相似，但診斷靈敏度(82.9%)略高于CCP2(78.6%)。但是，也有文獻(xiàn)[14]報道，Inova公司的CCP3與其他公司的CCP2相比并無明顯優(yōu)勢，這可能與各廠家所用的抗原肽純化技術(shù)不同而導(dǎo)致暴露的抗原決定簇存在差異有關(guān)。

2 包被方式和固相載體

固相化方式以及固相載體材料的選擇對于抗原抗體的反應(yīng)速率、洗滌分離以及靈敏度和線性范圍的檢測等具有重要意義。

2.1 包被方式 鏈霉親和素包被一直是臨床最常用的非共價包被方式。鏈霉親和素與生物素間具有很強的結(jié)合能力，一個鏈霉親和素可結(jié)合4個生物素分子，對目的分子的檢測信號有放大作用。房國祥等[15]在ELISA的基礎(chǔ)上建立了生物素-鏈霉親合素系統(tǒng)檢測抗-CCP抗體的方法，鏈霉親和素預(yù)包被(SA/Bio-CCP)的固相化模式對RA的診斷靈敏度和特異度分別為69.4%和96.8%。由于鏈霉親和素屬于堿性糖蛋白，分子量較大，易與聚苯乙烯塑料微孔板表面結(jié)合，故鏈霉親和素包被CCP不僅易將分子量較小的CCP固定于微孔板上，而且減小了反應(yīng)過程中的空間位阻。但是，在這種非共價固相方式中，CCP的吸附較隨意，且在吸附過程中CCP的分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，使功能部位無法暴露，影響CCP與抗體的結(jié)合。此外，由于CCP3為小分子多肽，其疏水區(qū)域極少，導(dǎo)致其不易充分吸附于SA/Bio-CCP模板的微孔上，易在洗滌過程中發(fā)生脫吸附現(xiàn)象。共價耦聯(lián)固相法可以解決上述問題，從而提高了檢測靈敏度。聚對二甲苯-H膜是甲?；揎椀膶Χ妆降木酆衔?，可以與蛋白質(zhì)或多肽的伯胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價連接，其與CCP一步孵育后，二者可共價連接[16]。共價耦聯(lián)法與非共價固相法的最低檢出限分別為0.1 ng/mL及100 ng/mL，共價耦聯(lián)法的固相化效率是非共價固相法的1000倍；根據(jù)兩者的截斷值(cut-off)，共價耦聯(lián)法的靈敏度和特異度均高于非共價固相法[17]。

2.2 固相載體 聚苯乙烯為ELISA檢測技術(shù)中的常用固相載體，這種固相載體材料的吸附表面平整，其包被和反應(yīng)的表面積較小，使得抗原抗體的反應(yīng)時間較長、檢測速度較慢、線性范圍較窄、易發(fā)生勾狀效應(yīng)。同時，由于抗原肽包被于聚苯乙烯表面且每一個反應(yīng)孔(杯)只能檢測一個固定項目，不利于高通量流水線自動化定量分析。因此，國內(nèi)外開發(fā)了新型的固相載體材料來彌補以上缺陷，如表面微粒化酶標(biāo)板、磁性微球。

磁性微球是國外應(yīng)用的主要固相載體，它是通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ褂袡C高分子與無機磁性物質(zhì)結(jié)合而形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球；可以通過共聚、表面改性等化學(xué)反應(yīng)方法在微球表面引入多種反應(yīng)性功能基團(tuán)，磁性微球也可通過共價鍵結(jié)合生物活性物質(zhì)，同時在外加磁場作用下，表現(xiàn)出強烈的磁響應(yīng)性，可以進(jìn)行快速分離。因此，磁性微球作為固相載體，具有快速分離、反應(yīng)表面積大以及接近均相反應(yīng)的優(yōu)勢，在一定程度上提高了檢測靈敏度和效率。

3 抗-CCP抗體檢測技術(shù)

隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展，抗-CCP抗體的檢測技術(shù)也在不斷改進(jìn)，由傳統(tǒng)的低通量、定性/半定量的檢測技術(shù)向高通量、定量的檢測技術(shù)發(fā)展，有效地提高了抗-CCP抗體的檢測效率、檢測性能以及臨床應(yīng)用價值。

3.1 定性檢測技術(shù)

3.1.1 斑點免疫印跡法(dot immunobinding assay，DIBA) DIBA法是利用硝酸纖維素膜或乙酸纖維素膜作為固相支持物、進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測方法。虞偉等[18]用DIBA法檢測抗-CCP抗體，并經(jīng)方陣滴定法確定最佳實驗條件；他們發(fā)現(xiàn)，DIBA法與歐蒙ELISA法檢測結(jié)果的一致性尚可(Kappa=0.714)；DIBA法的特異度略高于ELISA法，但其靈敏度(52%)低于ELISA法(60.4%)，并且DIBA法檢測抗-CCP抗體的穩(wěn)定性及重復(fù)性難以控制，檢測所需時間較長(2 h)。

3.1.2 膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay，GICA) GICA法是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等相結(jié)合的固相免疫檢測技術(shù)，其主要原理是將膠體金作為抗原示蹤標(biāo)記物，對檢測樣本中抗體的性質(zhì)、含量進(jìn)行分析。研究[19]顯示，GICA法與歐蒙ELISA法對抗-CCP抗體的檢測結(jié)果一致(Kappa=0.92～0.93)，總符合率為96.0%～97.3%；GICA法的靈敏度(84%)及特異度(98%)均較ELISA法高，且該方法操作簡單，僅需5 min就可用肉眼觀察結(jié)果，可用于快速篩查；但是，GICA法在實際應(yīng)用中易受反應(yīng)溫度、濕度、加樣量等因素影響。

3.2 定量檢測技術(shù) 化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)是臨床常用的定量檢測技術(shù)。該技術(shù)是將化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結(jié)合而建立起來的一種痕量分析方法，因其具有靈敏度和特異度高、重復(fù)性好、檢測范圍寬、檢測時間短、易于自動化等優(yōu)勢而成為臨床常用的檢測技術(shù)。目前，臨床上主要通過化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù)(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)和電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)檢測抗-CCP抗體。

3.2.1 CLEIA法 CLEIA法將堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等標(biāo)記的抗原與樣本中的抗體結(jié)合，加入發(fā)光劑，根據(jù)發(fā)光體系的發(fā)光強度進(jìn)行抗-CCP抗體的測定。Tanaka等[20]采用CLEIA法與ELISA法檢測抗-CCP抗體，發(fā)現(xiàn)CLEIA法對抗-CCP抗體的最低檢測限為0.1 U/mL，為ELISA法的10倍；CLEIA法的整個檢測過程僅需45 min；CLEIA法檢測抗-CCP抗體的重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均優(yōu)于ELISA法。近年來，有研究[21]評估了臨床常用的Abbott公司全自動化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)對抗-CCP抗體的檢測，結(jié)果顯示，該方法的檢測范圍為0.95～194.6 U/mL；CMIA的受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線下面積大于ELISA法，有較好的診斷性能；CMIA的最適cut-off值所對應(yīng)的診斷靈敏度與特異度分別為84.1%和94.2%，與ELISA法相比，其總體符合率達(dá)99.48%；此外，用CMIA法檢測抗-CCP抗體，可使其對RA的診斷性能優(yōu)于RF或抗角蛋白抗體(anti-keratin antibody，AKA)等指標(biāo)[22]。

3.2.2 ECLIA法 ECLIA法是用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離，檢測電極上三聯(lián)吡啶釕發(fā)光強度，以此定量檢測抗體。對ECLIA法的基本檢測特性的評估顯示，其批內(nèi)和天間變異系數(shù)分別為0.9%～1.8%和1.7%～2.4%，回收率為96.7%～98.6[23]；ROC曲線分析顯示，ECLIA法的診斷靈敏度為66.82%～75%，特異度為98.3%～98.7%。Cai等[24]將ECLIA法與歐洲診斷和歐蒙ELISA試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECLIA法與兩種ELISA法的一致性和相關(guān)性均較好(Kappa>0.97；rs >0.85)。同時，ECLIA法的精確度及臨床檢測性能相對于2種ELISA法有所提高，且整個檢測過程耗時較ELISA法短，更好地滿足了臨床需求。

3.3 新技術(shù) 20世紀(jì)90年代初，美國Luminex公司研發(fā)出一種高通量的新型生物分子檢測技術(shù)，稱為懸浮芯片技術(shù)(flexible multi-analyte profiling，xMAP)。該技術(shù)集流式技術(shù)、熒光微球、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體，將流式檢測與芯片技術(shù)較好地結(jié)合，使生物芯片反應(yīng)體系變?yōu)橥耆合喾磻?yīng)體系，也被稱為液相芯片技術(shù)。近年來，該技術(shù)也被用于抗-CCP抗體檢測[25]。

xMAP技術(shù)主要采用聚苯乙烯微珠，其內(nèi)部標(biāo)記有2種熒光染料，這2種熒光染料(各有10個濃度梯度)的不同配比產(chǎn)生100種不同編碼的微球，將這些微球表面包被不同的探針，即可同時定量檢測100種不同的抗體。分析時，依次加入目的分子和帶有熒光的報告分子，不同的微球表面探針、目的分子與報告分子間特異性結(jié)合，形成了一個懸浮芯片系統(tǒng)。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)原理，將微球排成單列，使其快速通過檢測通道，用2種激光進(jìn)行檢測。紅色激光激發(fā)微球內(nèi)部的熒光染料，檢測器捕獲信號，將不同微球進(jìn)行分類，即定性分析；綠色激光激發(fā)微球上結(jié)合報告分子，確定報告分子的數(shù)量即定量分析。該系統(tǒng)只記錄2種熒光同時出現(xiàn)的信號，不記錄未結(jié)合的報告分子信號，所以檢測過程中無需洗滌分離。

與ELISA法相比，xMAP的優(yōu)點有：(1)吸樣量少，一般為5 μL；(2)高通量，可以用一種試劑同時檢測一個樣本中的幾十種不同的分子；(3)高敏感性[26]，xMAP技術(shù)的最低檢出限(3.0 μg/mL)是ELISA法(1.5 μg/mL)的2倍；(4)線性范圍寬[26]，xMAP技術(shù)的線性范圍(0.06～1.7 μg/mL)比ELISA法(0.006～6.8 μg/mL)寬10倍；(5)重復(fù)性好，液相環(huán)境有利于保持檢測分子的天然構(gòu)象和活性，使結(jié)果更穩(wěn)定。

然而，研究[27]發(fā)現(xiàn)，40%人類血清中存在能與微珠非特異性結(jié)合的抗體，這種抗體類似于免疫測定中的“異嗜性抗體”。微珠與此類抗體結(jié)合會引起很強的非特異性的背景，影響檢測結(jié)果。Waterboer等[28]發(fā)現(xiàn)，用PVX(由聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮組成)或CBS-K試劑對血清進(jìn)行預(yù)處理能大幅度地減少非特異性背景，而對特異性信號僅有微弱影響。

綜上所述，抗原肽提純、合成技術(shù)、固相技術(shù)以及檢測系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和高通量多元化新技術(shù)的引入提高了抗-CCP抗體的檢測水平，縮短了檢測時間，為RA的臨床診斷、療效監(jiān)測、疾病活動預(yù)測等方面提供了更詳細(xì)且準(zhǔn)確的信息。

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